喉鱗癌caveolin-1和MVD表達(dá)及與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

黃清麗，皇甫輝，史 敏，靳陽子

山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，山西太原 030000

喉鱗癌caveolin-1和MVD表達(dá)及與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

黃清麗，皇甫輝，史 敏，靳陽子

山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，山西太原 030000

目的：探討喉鱗狀細(xì)胞癌組織中caveolin-1 mRNA及蛋白的表達(dá)和微血管密度（MVD）與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法：采用免疫組化法檢測40例喉鱗狀細(xì)胞癌組織中caveolin-1、CD34表達(dá)，并用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（semi-RT-PCR）技術(shù)檢測以上組織中caveolin-1mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：不伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌組（第1組）的caveolin-1 mRNA相對(duì)A值為0.450±0.050，伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌組（第2組）的caveolin-1 mRNA相對(duì)A值為0.701±0.073；caveolin-1蛋白第1組中陽性表達(dá)率為25.0%，第2組為65.0%，不論從基因還是蛋白水平，兩組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。CD34免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示第2組的MVD值為30.19±2.60顯著高于第1組值 21.34±4.62（P＜0.05）。 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中 caveolin-1 高表達(dá)與 MVD 升高呈正相關(guān)（r=0.875，P＜0.05），且二者與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。結(jié)論：caveolin-1在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)可能在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起了重要作用，與腫瘤血管形成關(guān)系密切。

Caveolin-1；喉鱗狀細(xì)胞癌；微血管密度；淋巴轉(zhuǎn)移

頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。近年研究發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)血管生成促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移，在腫瘤血管生成中，caveolin-1發(fā)揮重要的作用，但caveolin-1在喉鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移中的研究較少。本實(shí)驗(yàn)將從基因和蛋白水平探討caveolin-1在喉癌血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，為腫瘤的預(yù)防和治療提供新的臨床策略。

1 材料與方法

1.1 材料

選取我科2008年8月～2010年9月期間手術(shù)切除的標(biāo)本，20例不伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗狀細(xì)胞癌組織（第1組），20例伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗狀細(xì)胞癌組織（第2組）。所有喉鱗癌患者均為初發(fā)，術(shù)前均未接受任何放射或化學(xué)治療，每個(gè)喉標(biāo)本在術(shù)后立即取材，所取標(biāo)本切除均經(jīng)患者及患者家屬同意。caveolin-1多抗購自美國Santa Cruz公司，CD34抗體和小鼠二步法檢測試劑盒購自中杉金橋公司，SP試劑盒購自博奧森公司，Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix）和PCR試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)方法 caveolin-1免疫組織化學(xué)用SP方法，CD34免疫組織化學(xué)用小鼠二步法：常規(guī)石蠟包埋，3μm厚切片后，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽性組織切片作陽性對(duì)照。1.2.2 RT-PCR法 ①RNA的提?。簭拿恳粋€(gè)Eppendorf管中分別取0.1 g冷凍組織，在液氮中迅速磨碎，采用Trizol試劑提取總RNA。②RT-PCR：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，引物序列：caveolin-1 為 5′-ACA TCT CTA CAC CGT TCC CAT-3′，5′-TGT GTG TCC CTT CTG GTT CTG-3′，GAPDH 為 5′-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3′，5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG GA-3′，按說明書操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，并配成50μl反應(yīng)體系中，于PCR擴(kuò)增儀循環(huán)32個(gè)周期，擴(kuò)增條件：94℃變性 20 s，58℃退火 20 s，72℃延伸 20 s，GAPDH 為內(nèi)對(duì)照同時(shí)擴(kuò)增。取PCR產(chǎn)物10μl，于2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果并拍照記錄。caveolin-1和GAPDH的擴(kuò)增片段分別為206 bp和307 bp。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 免疫組化法 采用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察caveolin-1的表達(dá)情況，細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜呈棕黃、棕褐色為陽性細(xì)胞。按染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)算評(píng)分：a染色強(qiáng)度（0=無色，1=淡黃色，2=棕黃色，3=棕褐色），b陽性細(xì)胞數(shù) （0=陽性細(xì)胞數(shù)0～5%，1=陽性細(xì)胞數(shù) 6%～25%，2=陽性細(xì)胞數(shù) 25%～50%，3=陽性細(xì)胞數(shù)＞50%）。a+b之和即為最后得分，得3～6分者為免疫組化陽性。

MVD計(jì)數(shù)：在不知臨床及病理特征的情況下，在低倍鏡下篩選出最高微血管密度區(qū)，在放大200倍的視野下記錄5個(gè)視野的微血管數(shù)，取其平均數(shù)[1]，管腔徑＞8個(gè)紅細(xì)胞直徑或有肌層的血管不計(jì)數(shù)。

1.3.2 RT-PCR法 電泳后用自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)半定量測定caveolin-1各區(qū)帶的吸光度值（A值），每例標(biāo)本相對(duì)A值為caveolin-1 A值/GAPDH A值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)，Spearman相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Caveolin-1陽性表達(dá)主要在腫瘤細(xì)胞胞膜和胞漿的棕黃色顆粒中，血管內(nèi)皮細(xì)胞也有表達(dá)（圖1），CD34陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色顆粒（圖2）。caveolin-1在第2組和第1組中陽性表達(dá)率分別為65.0%和25.0%，MVD在第2組和第 1組中表達(dá)分別為 30.19±2.60和 21.34±4.62（P＜0.05）。caveolin-1陽性組和陰性組喉鱗癌組織中的MVD分別是27.88±6.04和 20.65±3.97，說明caveolin-1和 MVD 呈正相關(guān)（r=0.875，P＜0.05）。caveolin-1mRNA 在第 2 組和第 1 組中的表達(dá)分別為 0.701±0.073 和 0.450±0.050（圖 3），caveolin-1 mRNA表達(dá)增多與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性（P＜0.05）。

3 討論

喉鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)脈管系統(tǒng)參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程，腫瘤血管不僅為腫瘤細(xì)胞快速生長提供養(yǎng)料和氧分，而且增生的新生血管增加了腫瘤進(jìn)入脈管的機(jī)會(huì)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[2]。一些研究顯示，乳腺癌[3]、大腸癌[4]等腫瘤中，腫瘤內(nèi)新生血管生成影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，腫瘤內(nèi)微血管密度的增加與局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)瘤內(nèi)高表達(dá)MVD促進(jìn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與上述觀點(diǎn)一致。瘤內(nèi)微血管生成可能通過以下機(jī)制促進(jìn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有充足血供的腫瘤細(xì)胞迅速增殖，與瘤周形成壓力差，促使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入瘤周微淋巴管形成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

caveolin-1是細(xì)胞膜上凹陷微區(qū)域caveolae的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其在腫瘤侵襲[5]和血管生成[6]中起重要作用。Yu等[7]發(fā)現(xiàn)caveolin-1的高表達(dá)可以促進(jìn)肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。Barresi等[8]研究也發(fā)現(xiàn)caveolin-1表達(dá)上調(diào)與腦膜瘤MVD呈正相關(guān)。在對(duì)腎透明細(xì)胞癌研究中，發(fā)現(xiàn)caveolin-1表達(dá)上調(diào)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并與腫瘤微血管密度（MVD）呈正相關(guān)[9]。本研究結(jié)果表明，無論在蛋白水平還是基因水平，伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組caveolin-1表達(dá)高于不伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，說明caveolin-1的表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

腫瘤的血管生成包括血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和分化過程。Beardsley等[10]研究發(fā)現(xiàn)，caveolin-1具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的功能，與血管生成有關(guān)。Liu等[11]發(fā)現(xiàn)caveolin-1表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)有關(guān)：以腺病毒為載體在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)caveolin-1，內(nèi)皮細(xì)胞分化成管狀結(jié)構(gòu)增加3倍，而降低caveolin-1表達(dá)，則管狀結(jié)構(gòu)數(shù)降低10倍以上。張志波等[12]研究發(fā)現(xiàn)caveolin-1基因沉默的人肝細(xì)胞癌株SMMC7721條件培養(yǎng)基能顯著降低HUVEC中eNOS ser-1177位點(diǎn)的磷酸化表達(dá)，從而抑制VEGF介導(dǎo)的eNOS活化引起的HUVEC管腔結(jié)構(gòu)形成。本研究也顯示，瘤內(nèi)caveolin-1表達(dá)增高與瘤內(nèi)MVD表達(dá)升高具有相關(guān)性，提示caveolin-1可能通過誘導(dǎo)血管生成參與介導(dǎo)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，caveolin-1可能與喉鱗狀細(xì)胞癌血管生成相關(guān)，進(jìn)而促進(jìn)喉癌侵襲和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。caveolin-1和MVD可能成為預(yù)測喉鱗狀細(xì)胞癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。利用caveolin-1抗體阻斷喉癌血管生成可能成為抗喉腫瘤侵襲的有效手段之一。

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Relationship among the expression of the caveolin-1 and MVD with cervical lym ph nodesmetastasis in laryngeal squamous cell carcinoma

HUANGQingli,HUANGFUHui,SHIMin,JINYangzi
Departmentof Otolaryngology,the First Clinical Affiliated Hospital of ShanxiMedical University,Taiyuan 030000,China

Objective:To study the relation among the expression of the caveolin-1 and microvessel density(MVD)with cervical lymph nodesmetastasis in laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC).Methods:The expression of caveolin-1 and CD34 in 40 samples of tumor were detected by immunohistochemical method.The expression of caveolin-1 mRNA in samples of tumor was detected by semi-RT-PCR technique.Results:The caveolin-1 mRNA A of LSCC without cervical lymph nodesmetastasis was(the first group)0.450±0.050,the caveolin-1 mRNA A of LSCC with cervical lymph nodes metastasiswas(the second group)0.701±0.073;the positive rate of the caveolin-1 protein expression in the first group was 25.0%,in the second group was 65.0%,caveolin-1 was higher either atmolecular level or at the protein level in the second group than the firstgroup(all P＜0.05).The expression ofMVDmarked by CD34 in the second group was 30.19±2.60,and in the first group was 21.34±4.62,the expression of MVD in the second group was higher than the first group(P＜0.05).The over expression of caveolin-1 had a positive correlation with a higher MVD and were both related to cervical lymph nodesmetastasis in the 40 cases(r=0.875,P＜0.05).Conclusion:These results suggest thatover expression of caveolin-1may play a very important role in themetastasisof laryngeal squamous cell carcinoma and is closely correlated with angiogenesis.

Caveolin-1;Laryngeal squamous cell carcinoma;Microvessel density;Lymphaticmetastasis

R739.65

A

1673-7210（2011）03（b）-025-03

黃清麗（1985-），女，河北臨漳人，碩士研究生，從事頭頸部腫瘤方向研究。

皇甫輝，主任醫(yī)師。

2010-01-04）