花椒總生物堿鎮(zhèn)痛、抗炎、止癢作用研究

石雪萍,張衛(wèi)明,張鳴鏑,關(guān)榮琴

(1.南京野生植物綜合利用研究院,江蘇南京 210042;2.吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院,吉林長春 130062)

花椒 (Zan thoxylum bungeanum Maxim.),屬蕓香科 (Rutaceae)花椒屬植物[1],是傳統(tǒng)的調(diào)味料和中藥?；ń返幕瘜W(xué)成分主要有揮發(fā)油、生物堿、酰胺、木脂素、香豆素和脂肪酸等[2]。花椒的果實(shí)、根、莖和葉均可入藥,《中國藥典》記載,花椒有“溫中止痛,殺蟲止癢”的功效。民間有用花椒煎水外洗,常配苦參、蛇床子、白蘚皮等,以清熱燥濕止癢,用于濕疹瘙癢,陰癢[3]。生物堿是花椒屬植物中普遍含有的一類物質(zhì),這些生物堿按其母核可分為四大類:喹啉衍生物類、異喹啉衍生物類、苯并菲啶衍生物類和喹諾酮衍生物類[4-5]。普遍存在于花椒屬中的茵芋堿具有鎮(zhèn)痛、解痙和鎮(zhèn)靜作用[6]。本研究通過大孔樹脂純化花椒總生物堿,并采用小鼠熱板法探索其鎮(zhèn)痛作用,并研究了花椒生物堿的抗炎、止癢作用,旨在促進(jìn)花椒綜合利用技術(shù)的發(fā)展,為花椒的進(jìn)一步研究開發(fā)提供理論依據(jù),從而擴(kuò)大其在外用藥、化妝品等方面的應(yīng)用,推動我國花椒產(chǎn)業(yè)化步伐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物樣品

花椒,產(chǎn)地四川茂汶,經(jīng)南京野生植物院肖正春教授鑒定為蕓香科植物花椒 (Z.bungeanum M axim.)品種。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物

小鼠,普通級,體重 25～28 g,雌雄兼用,由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供 [動物合格證號SCSK(蘇)2007-0008];受試動物受試前適應(yīng)環(huán)境5 d,自由攝食、飲水。

1.1.3 藥物與試劑

阿司匹林泡騰片,批號 0909048,阿斯利康制藥有限公司;生理鹽水,自制,高壓濕熱滅菌 (121℃,20 m in),備用。復(fù)方醋酸地塞米松乳膏,批號090801,湖北科田藥業(yè)有限公司;醋酸氟輕松乳膏,批號 100322,天津太平洋制藥有限公司;低分子右旋糖酐 -40(Dextranum-4),批號 060924,陜西西康樂制藥廠;二甲苯,南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花椒生物堿的制備

將花椒果皮粉碎后稱取 1 000 g,加入 pH 3的70%乙醇,料液比 1∶10,在 60℃提取 4 h,減壓回收乙醇[10],水提液用氨水調(diào) pH至 9～10,置于 4℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用NKA-9大孔樹脂先分別以水和50%乙醇洗脫除去水溶性雜質(zhì),再用 70%乙醇反復(fù)洗脫至無生物堿特征反應(yīng),洗脫液減壓濃縮得大孔樹脂洗脫物 23.6 g。

1.2.2 小鼠熱板法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)[7-9]

用分析天平準(zhǔn)確稱取純化后的花椒生物堿,無菌生理鹽水配制成高、中、低 3種濃度梯度供試液,每毫升分別相當(dāng)于生藥 472 m g、236 m g、118 m g。取雌性小鼠 50只,隨機(jī)分為對照組,花椒生物堿高、中、低濃度供試液組及阿司匹林組共 5組,每組 10只。每組小鼠分別灌胃給藥,給藥容積均為 0.2 mL/10 g,對照組灌胃等容積生理鹽水,連續(xù)給藥 3天。末次給藥 30 m in后,用秒表記錄小鼠自投入恒溫水浴的燒杯中[溫度控制在 (55±0.5)℃]至出現(xiàn)舔后足的時間(s)作為該鼠的痛閾值。剔除痛閾值小于 5 s、大于 30 s或出現(xiàn)跳躍反應(yīng)的小鼠。記錄給藥后 30 m in,60 m in,90 m in時的痛閾值,如痛閾超過 60 s,按 60 s計(jì),并比較組間差異。

1.2.3 對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響[10-13]

取 1.2.1節(jié)制備的花椒生物堿,用 70%乙醇配制為高、中、低 3種濃度供試液,每毫升分別相當(dāng)于生藥 94.4 m g、47.2 m g、23.6 m g。

雄小鼠 50只,分為 5組,即溶劑組,高、中、低濃度花椒生物堿供試液 (和復(fù)方醋酸地塞米松組,每組 10只。實(shí)驗(yàn)前 2 d小鼠右耳涂藥 2次,涂藥間隔6 h,實(shí)驗(yàn)當(dāng)日涂藥 1次,30μL/次,涂藥時先將小鼠用乙醚麻醉。末次涂藥后 30 m in,在小鼠右耳正反面涂布致炎劑二甲苯 25μL/只,左耳作對照,40 m in后頸椎脫臼處死小鼠,沿耳廓基線立即剪下雙耳,用7 mm打孔器分別在雙耳同一部位打下圓耳片,精密稱重,右耳重量減去左耳重量為腫脹度,比較各組腫脹度值,同時計(jì)算腫脹抑制率。

腫脹抑制率(%)=(溶劑組腫脹度 -花椒生物堿供試液或陽性對照組腫脹度)/溶劑組腫脹度 ×100%

1.2.5 對低分子右旋糖酐 -40誘發(fā)小鼠皮膚瘙癢的影響[14-15]

將小鼠 50只,雌性,隨機(jī)分為對照組,花椒生物堿高、中、低濃度供試液組及氟輕松組共 5組,每組10只。實(shí)驗(yàn)前 2 d用脫毛劑將小鼠背部脫毛,脫毛面積約為 9 cm2,然后分別將藥物均勻涂擦于脫毛區(qū),模型對照組擦等量生理鹽水,每天涂 2次,共 5次。末次涂藥 30 m in后,向各組小鼠鼠尾靜脈注射0.025%右旋糖苷 -40(1.25 m g/m L)。以小鼠前爪搔抓頭部,后爪搔抓軀干,啃咬全身各部位作為瘙癢特征。觀察記錄首次搔抓的時間 (潛伏時間)及 30 m in內(nèi)瘙癢次數(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 花椒生物堿對熱板法小鼠疼痛反應(yīng)的影響

按照 1.2.4節(jié)方法,采用小鼠熱板法考察花椒生物堿的鎮(zhèn)痛作用,結(jié)果見表2。

表1 花椒生物堿對熱板法引起小鼠疼痛的影響 ±s,n=10)

表1 花椒生物堿對熱板法引起小鼠疼痛的影響 ±s,n=10)

與對照組比較,＊ P<0.05,＊＊ P<0.01。

組別 劑量 C/mg·kg-1給藥后不同時間段小鼠痛閾/s 30 m in 60 m in 90 m in對照組 - 11.72±3.22 1±2.32 31±1.45阿司匹林 200 13.79±1.93 ±170±3.33＊＊花椒生物堿 (低) 118 13.1±213.30±2.20花椒生物堿 (中) 236 17.0.63±2.80＊＊ 17.00±2.74＊＊花椒生物堿 (高) 472 136±2.30＊＊ 17.17±3.51＊＊ 17.19±3.06＊＊

表1的試驗(yàn)結(jié)果表明,阿司匹林組 60 m in明顯提高熱板法小鼠的痛閾值,與空白組比較差異具有顯著性 (P<0.05)。花椒生物堿低劑量組對小鼠鎮(zhèn)痛作用不明顯,表現(xiàn)為疼痛閾值沒有顯著變化。高、中劑量組均能顯著提高小鼠對熱的痛閾值,且在 30 m in時,就能表現(xiàn)出比阿司匹林組更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效果,持續(xù)時間較長,與對照組比較差異顯著 (P<0.01)。以上結(jié)果顯示,花椒生物堿對小鼠熱刺激引起的疼痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用。

2.2 花椒生物堿對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

表2 花椒生物堿對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹度的影響 ±s,n=10)

表2 花椒生物堿對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹度的影響 ±s,n=10)

與對照組比較,＊ P<0.05,＊＊P<0.01。

組別 腫脹度/m·mg-1 抑制率/%對照組 7.17±2.14 -復(fù)方醋酸地塞米松組 2.33±0.82 67.50＊＊花椒生物堿 (高) 4.17±1.47 41.84＊＊花椒生物堿 (中) 5.67±0.52 20.92＊花椒生物堿 (低) 6.33±0.52 11.72

表2結(jié)果表明,與對照組相比,高濃度花椒生物堿供試液對二甲苯所致小鼠耳腫脹有較顯著的抑制作用 (P<0.01),腫脹抑制率為 41.84%;中濃度花椒生物堿對二甲苯所致小鼠耳腫脹抑制作用較顯著(P<0.05),腫脹抑制率為 20.92%,低濃度的花椒生物堿對二甲苯所致小鼠耳腫脹抑制作用不顯著,抑制率為 11.72%。此結(jié)果說明了一定濃度的花椒生物堿具有一定的抗炎作用。

2.3 花椒生物堿對小鼠皮膚瘙癢的止癢作用

表3 花椒生物堿對小鼠皮膚瘙癢的止癢作用 ±s,n=10)

表3 花椒生物堿對小鼠皮膚瘙癢的止癢作用 ±s,n=10)

與對照組比較,＊ P<0.05,＊＊ P<0.01。

組別 潛伏時間/s 瘙癢次數(shù)/次對照組 117±18 61.50±5.58氟輕松組 273±19 26.33±1.63＊＊花椒生物堿 (高) 215±30 33.00±4.20＊＊花椒生物堿 (中) 202±19 44.50±4.04＊花椒生物堿 (低) 160±30 54.17±4.58

表3結(jié)果表明,花椒生物堿具有減輕小鼠瘙癢癥狀的功能。氟輕松組和高濃度的花椒生物堿止癢作用明顯(P<0.01),中濃度劑量的花椒生物堿止癢作用較顯著(P<0.05),低劑量的花椒生物堿幾乎沒有止癢作用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用熱板法研究花椒生物堿的鎮(zhèn)痛效果,結(jié)果表明,花椒生物堿對小鼠熱刺激引起的疼痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用,能延長熱痛反應(yīng)中小鼠舐后足的時間,其作用呈一定的量效關(guān)系;二甲苯致炎法及低分子右旋糖酐 -40誘發(fā)小鼠皮膚瘙癢研究花椒生物堿抗炎、止癢作用,結(jié)果顯示花椒生物堿能較強(qiáng)抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹,并能輕微緩解分子右旋糖酐 -40誘發(fā)的小鼠皮膚瘙癢。由此可見,花椒生物堿具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、抗炎、止癢作用,有待進(jìn)一步開發(fā)研究。

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