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    粵藍(lán)鏈霉菌中紫羅蘭藍(lán)色素成分的分離與鑒定*

    2011-01-24 06:20:52鄧名榮朱春華郭俊朱紅惠
    關(guān)鍵詞:紫羅蘭霉菌色素

    鄧名榮 朱春華 郭俊 朱紅惠?

    (1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州510006;2.廣東省微生物研究所廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室,廣東廣州510070)

    食用色素作為著色劑在加工食品中廣泛應(yīng)用.食用色素可分為合成色素和天然色素兩大類.隨著合成色素使用量的增長,由合成色素引起的一些安全問題也不斷出現(xiàn),如國內(nèi)的“孔雀石綠”、“蘇丹紅”等事件引起人們對色素安全問題的廣泛關(guān)注.與合成色素相比,天然色素具有安全性相對較高,同時色調(diào)自然等優(yōu)點,許多天然色素還具有增強人體營養(yǎng)、保健等功能[1],因此,近年來天然色素日趨受到消費者的青睞.然而,與之相悖的是,在實際生產(chǎn)中天然色素使用并不廣泛,目前我國批準(zhǔn)使用的天然色素有60余種,但真正產(chǎn)業(yè)化的僅有10余種,如辣椒紅、姜黃色素等[2].主要原因是:①天然色素絕大部分來源于植物,含量低,提取困難,生產(chǎn)成本較高,且受植物生長周期的限制;②天然色素色系單調(diào),以紅、黃為主,而藍(lán)色色系罕見.

    微生物能產(chǎn)生豐富的色素,其生長周期短,易于人工控制和大規(guī)模生產(chǎn),不受原材料和季節(jié)的限制,并可通過誘變提高產(chǎn)量.因此,通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然色素成為研究的熱點[1,3-4],特別是從微生物中尋找藍(lán)色等稀有天然色素更受關(guān)注.張和春等[5-7]對一株天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces ceolicolor)所產(chǎn)藍(lán)色素的色素性質(zhì)、發(fā)酵動力學(xué)以及結(jié)構(gòu)和毒性進(jìn)行了研究,認(rèn)為該藍(lán)色素具有開發(fā)的潛力.近年Zhu等[8]從熱帶原始森林土壤中分離獲得一株鏈霉菌新種——粵藍(lán)鏈霉菌(S.vietnamensis),該菌能在多種培養(yǎng)基中產(chǎn)生水溶性紫羅蘭藍(lán)色素,色調(diào)優(yōu)美,非常值得進(jìn)一步研究開發(fā).筆者已對該菌次級代謝產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其具有抗菌和抗腫瘤的活性[9].本研究對該菌的產(chǎn)色發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,并綜合采用多種手段,分離鑒定了其中主要的呈色物質(zhì).

    1 試驗

    1.1 菌株、試劑和儀器

    粵藍(lán)鏈霉菌GIMV4.0001T,由廣東省微生物菌種保藏中心提供.乙酸乙酯等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純.柱層析硅膠(200-300目)、薄層層析(TLC)硅膠GF254(10~20μm)均購自青島海洋化工廠.葡聚糖凝膠Sephadex LH-20為法瑪西亞產(chǎn)品.高效液相色譜(HPLC)在島津LC-20A色譜儀上進(jìn)行.色譜柱為 Hypersil ODS-2 柱(5 μm,250.0 mm ×4.6 mm,分析用)和Discovery C18柱(5μm,250mm×10mm,半制備用).核磁共振(NMR)氫譜(1H)、碳譜(13C)在Brüker Avance(600 MHz)核磁共振波譜儀上測定;四甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標(biāo),氘代溶劑為氘代氯仿(CDCl3)、氘代丙酮(ACETONE-d6)、氘代二甲基亞砜(DMSO-d6).質(zhì)譜(MS)在LCQ Deca質(zhì)譜儀上完成.

    1.2 試驗方法

    1.2.1 產(chǎn)色培養(yǎng)基的選擇及發(fā)酵條件的正交優(yōu)化

    色素是鏈霉菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,不同營養(yǎng)成分對鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物的種類和產(chǎn)量有非常重要的影響.首先測試粵藍(lán)鏈霉菌培養(yǎng)基在4種培養(yǎng)基中產(chǎn)藍(lán)色素的能力,即YEME培養(yǎng)基(酵母提取物3g,蛋白胨5g,麥芽提取物3g,葡萄糖10g,補水至1L,pH=7.2,滅菌后加入2.5mol/L MgCl22mL),高氏合成一號培養(yǎng)基(可溶性淀粉 20.00 g,KNO31.00 g,K2HPO40.50 g,MgO4·7H2O 0.50 g,NaCl 0.50g,F(xiàn)eSO40.01g,補水至 1 L,pH=7.2),YMS 培養(yǎng)基(酵母提取物4g,可溶性淀粉4 g,麥芽提取物10g,CoCl2·6H2O 5mg,補水至 1 L,pH=7.2),YD培養(yǎng)基(酵母提取物4.0g,麥芽提取物10.0 g,葡萄糖4.0g,MgCl22.0 g,CaCl21.5 g,補水至 1 L,pH=7.2).然后采用選取的適宜培養(yǎng)基對接種量、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時間等參數(shù)進(jìn)行正交優(yōu)化,正交試驗按4因素3水平L9(34)進(jìn)行設(shè)計(見表1),每個處理重復(fù)3次.產(chǎn)色素能力的評價采用比色法:培養(yǎng)3天后,離心,取50μL上清用三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸二鈉緩沖液(pH=8.0)定容至1mL,測定580nm波長處的吸光值.

    1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的提取、分離和鑒定

    發(fā)酵液經(jīng)離心(6000g、20min),過濾,使菌液分離.過濾液用等體積乙酸乙酯萃取3次,50℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮,獲得粗提物.分離純化時,將粗提物用最小體積的甲醇重新溶解,溶液置于-20℃過夜以去除蠟質(zhì),重新蒸干后,硅膠柱層析,用氯仿/甲醇系統(tǒng)依次洗脫,粗分各部位反復(fù)用Sephadex LH-20凝膠柱、半制備TLC及HPLC進(jìn)行用分離純化,具體流程見圖1.NMR測定時,根據(jù)樣品的溶解性能來選擇氘代溶劑.MS測定時,根據(jù)樣品的電離難易程度選擇大氣壓化學(xué)電離(APCI)、電噴霧電離(ESI)等不同電離方式.化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)主要根據(jù)1H譜、13C譜和MS等數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]進(jìn)行解析.

    圖1 紫羅蘭藍(lán)色素分離純化流程圖Fig.1 Flow chart of isolation and purification the violet-blue pigment

    2 結(jié)果與討論

    2.1 產(chǎn)色適宜的發(fā)酵條件及色素提取

    粵藍(lán)鏈霉菌在YEME、YD、YMS、高氏合成一號4種培養(yǎng)基中的色素產(chǎn)量差異較大,發(fā)酵上清液吸光值 D(580)均值分別為 4.76、6.78、3.61、10.52,可見高氏合成一號培養(yǎng)基是適宜的產(chǎn)色培養(yǎng)基,因此選用該培養(yǎng)基開展后續(xù)研究.由于高氏合成一號培養(yǎng)基主要成分是淀粉和無機(jī)鹽,原材料價格低廉,因此也可作為工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基.進(jìn)一步對接種量、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時間等參數(shù)進(jìn)行正交優(yōu)化,結(jié)果見表1.方差分析(見表2)表明,4個因素對色素量均有顯著影響(P<0.01),影響力依次為搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時間和接種量.極差分析表明(見表1),接種量、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時間的最大均值分別出現(xiàn)在水平2、水平2、水平3、水平3,即優(yōu)化的培養(yǎng)參數(shù)組合為:接種量5%(體積分?jǐn)?shù),余同),培養(yǎng)溫度30℃,180r/min振動培養(yǎng)7d.利用該培養(yǎng)參數(shù),色素D(580)可達(dá)12.36.批量發(fā)酵共40L,乙酸乙酯提取后共獲得粗提物38.6g.

    表1 粵藍(lán)鏈霉菌產(chǎn)色發(fā)酵優(yōu)化正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Orthogonal design and results of pigment fermentation optimization of S.vietnamensis

    表2 粵藍(lán)鏈霉菌產(chǎn)色發(fā)酵優(yōu)化試驗結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of the results of pigment fermentation optimization of S.vietnamensis

    2.2 紫羅蘭藍(lán)色素成分的純化及其結(jié)構(gòu)

    從乙酸乙酯粗提物中分離純化獲得7個單體化合物,其中化合物4、7為新化合物,各化合物的分離流程見圖1.TLC分析表明化合物1、7是紫羅蘭藍(lán)色素的兩個主要呈色物質(zhì).結(jié)構(gòu)解析的具體結(jié)果如下.

    化合物1 深紅色針晶,堿性水溶液中呈藍(lán)色,酸性水溶液中呈紅色,APCI-MS:m/z 445[M+H]+,m/z 443[M -H]-,表明其相對分子質(zhì)量為444.1H NMR(600MHz,CDCl3)圖譜主要化學(xué)位移:12.89(1H,s,11-OH),12.79(1H,s,8-OH),6.35(1H,s,20-OH),5.33(1H,d,J=2.4 Hz,4-H),5.22(1H,q,J=6.0Hz,15-H),5.20(1H,dd,J=3.6,1.8Hz,17-H),4.74(1H,dd,J=14.9,3.0 Hz,3-H),4.02(1H,dd,J=8.4,1.8 Hz,19-H),3.80(1H,q,J=6.0Hz,21-H),2.99(1H,dd,J=13.2,4.8 Hz,2a-H),2.72(2H,d,J=18.0 Hz,2b-H,18a-H),2.62(1H,s,19-OH),1.59(3H,d,J=6.0Hz,16-H),1.56(2H,dd,J=14.4,1.8 Hz,18b-H),1.03(3H,q,J=6.0Hz,22-H).13C NMR(150MHz,CDCl3)圖譜主要化學(xué)位移:171.7(C-1),36.9(C-2),66.9(C-3),72.8(C-4),138.3(C-5),174.0(C-6),110.3(C-7),165.1(C-8),145.3(C-9),130.9(C-10),166.8(C-11),111.6(C-12),178.5(C-13),145.3(C-14),70.9(C-15),18.2(C-16),68.8(C-17),35.5(C-18),66.2(C-19),80.6(C-20),61.7(C-21),16.56(C-22).其理化性質(zhì)和波譜學(xué)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報道的一致,鑒定為榴菌素(見圖2(a)).

    化合物2 棕黃色針晶,ESI-MS:m/z 433[M+Na]+,m/z 843[2M+Na]+,表明其相對分子質(zhì)量為410.1H NMR(600 MHz,CDCl3)圖譜主要化學(xué)位移:13.40(1H,s,6-OH),13.25(1H,s,13-OH),8.39(1H,dd,J=7.8,1.2 Hz,17-H),8.26(1H,dd,J=7.8,1.2Hz,19-H),7.86(1H,t,J=7.8Hz,18-H),5.99(1H,q,J=6.3Hz,21-H),5.44(1H,d,J=3.0 Hz,4-H),5.31(1H,q,J=6.9 Hz,15-H),4.79(1H,dd,J=4.8,3.0 Hz,3-H),3.01(1H,dd,J=17.7,5.1 Hz,2a-H),2.75(1H,br d,J=17.4 Hz,2b-H),1.61(3H,d,J=6.3Hz,22-H),1.60(3H,d,J=6.9Hz,16-H).13C NMR(150 MHz,CDCl3)圖譜主要化學(xué)位移:172.7(C-1),36.8(C-2),64.3(C-3),72.5(C-4),134.4(C-5),156.3(C-6),111.8(C-7),186.3(C-8),133.7(C-9),132.7(C-10),189.8(C-11),110.5(C-12),153.7(C-13),139.8(C-14),67.8(C-15),19.3(C-16),125.5(C-17),132.7(C-18),128.2(C-19),149.6(C-20),63.8(C-21),26.9(C-22).其理化性質(zhì)和波譜學(xué)數(shù)據(jù)與醌茜蘭類色素Zg一致[11],鑒定為色素 Zg(見圖2(b)).

    化合物3 橙色針晶,ESI-MS:m/z 431[M+Na]+,m/z 839 [2M+Na]+,表明其相對分子質(zhì)量為408.1H NMR(600 MHz,CDCl3)圖譜主要化學(xué)位移:13.34(1H,s,6-OH),12.73(1H,s,13-OH),8.45(1H,dd,J=7.5,1.2 Hz,17-H),7.92(1H,t,J=7.5Hz,18-H),7.58(1H,dd,J=7.5,1.2 Hz,19-H),5.44(1H,d,J=3.0 Hz,4-H),5.32(1H,q,J=6.6Hz,15-H),4.79(1H,dd,J=4.8,3.0 Hz,3-H),3.01(1H,dd,J=17.4,5.4 Hz,2a-H),2.72(1H,br d,J=18.0Hz,2b-H),2.60(3H,s,22-H),1.58(3H,d,J=6.6 Hz,16-H).13C NMR(150 MHz,CDCl3)圖譜主要化學(xué)位移:173.1(C-1),36.2(C-2),64.6(C-3),73.3(C-4),134.1(C-5),156.1(C-6),110.9(C-7),183.5(C-8),135.7(C-9),133.7(C-10),190.3(C-11),110.5(C-12),153.7(C-13),139.7(C-14),68.1(C-15),19.3(C-16),131.3(C-17),132.4(C-18),128.8(C-19),142.6(C-20),201.8(C-21),29.6(C-22).其理化性質(zhì)和波譜學(xué)數(shù)據(jù)與醌茜蘭類色素 Zgg[11]相符,鑒定為色素 Zgg(見圖2(b)).

    圖2 粵藍(lán)鏈霉菌紫羅蘭藍(lán)色素化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of the violet-blue pigment of S.vietnamensis

    化合物4 棕黃色針晶,ESI-MS:m/z 413[M+H]+,m/z 411[2M -H]-,表明其相對分子質(zhì)量為412.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)圖譜主要化學(xué)位移:13.48(1H,s,6-OH),13.23(1H,s,13-OH),8.34(1H,d,J=7.7 Hz,17-H),8.23(1H,d,J=6.8 Hz,19-H),7.94(1H,t,J=7.7 Hz,18-H),5.98(1H,q,J=6.1Hz,21-H),5.21(1H,br s,1-OH),5.06(1H,q,J=6.6 Hz,15-H),4.32(1H,m,3-H),2.92(1H,dd,J=18.1,3.2Hz,2a-H),2.68(1H,d,J=4.3 Hz,4a-H),2.49(1H,被 δ 2.68 屏蔽,4b-H),2.48(1H,被 δ 2.68 屏蔽,2b-H),1.53(3H,d,J=6.6 Hz,16-H),1.37(3H,d,J=6.1Hz,22-H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6)圖譜主要化學(xué)位移:181.8(C-1),41.0(C-2),64.8(C-3),38.9(C-4),133.7(C-5,C-9),154.3(C-6),110.7(C-7),186.5(C-8),134.4(C-10),190.0(C-11),109.7(C-12),153.2(C-13),139.5(C-14),67.2(C-15),18.5(C-16),125.7(C-17),133.0(C-18),128.3(C-19),152.8(C-20),62.8(C-21),27.5(C-22).該化合物氫譜、碳譜數(shù)據(jù)與化合物2相似,二者的差別主要在 C-1、C-4.δ181.8(C-1)提示該碳原子為羧酸基團(tuán)的羰基碳,氫譜中化學(xué)位移5.21(1H,br s,1-OH)也說明該碳原子上連有一個羥基,δ38.9(C-4)提示該碳原子為仲碳,其上連有兩個化學(xué)位移分別為2.68、2.49的氫原子,說明羧酸基團(tuán)未在C-4上形成內(nèi)酯環(huán).質(zhì)譜顯示該化合物的相對分子質(zhì)量比化合物2大2,因此該化合物是化合物2的二氫形式,即二氫Zg(見圖2(c)).

    化合物5 深紅色針晶,堿性水溶液中呈藍(lán)色,酸性水溶液中呈紅色;APCI-MS:m/z 581[M+Na]+,m/z 557[M -H]-,表明其相對分子質(zhì)量為558.1H NMR(600 MHz,ACETONE-d6)圖譜主要化學(xué)位移:13.01(1H,s,8-OH),12.86(1H,s,11-OH),5.45(1H,d,J=2.4Hz,4-H),5.16(1H,q,J=6.6Hz,5-H),5.16(1H,d,J=3.0 Hz,17-H),4.94(1H,dd,J=5.4,3.0Hz,3-H),4.83(1H,d,J=3.0Hz,1'-H),4.11(1H,q,J=6.6 Hz,5'-H),4.07(1H,dd,J=7.8,1.2 Hz,19-H),3.81(1H,q,J=6.0 Hz,21-H),3.48(1H,br s,4'-H),3.21(1H,dd,J=17.4,5.4 Hz,2a-H),2.69(1H,d,J=14.5,7.8,3.0Hz,18a-H),2.52(1H,d,J=17.4 Hz,2b-H),1.96(1H,m,3'a-H),1.81(1H,m,3'b-H),1.61(3H,d,J=6.6Hz,16-H),1.56(1H,d,被 δ1.50 屏蔽,18b-H),1.50(1H,m,2'a-H),1.20(1H,m,2'b-H),1.17(3H,d,J=6.6 Hz,6'-H),0.96(3H,d,J=6.0 Hz,22-H).13C NMR(150 MHz,ACETONE-d6)圖譜主要化學(xué)位移:173.8(C-1),37.4(C-2),66.8(C-3),68.2(C-4),141.2(C-5),176.6(C-6),112.2(C-7),168.5(C-8),147.2(C-9),139.7(C-10),169.8(C-11),110.9(C-12),173.1(C-13),133.3(C-14),62.5(C-15),18.3(C-16),67.3(C-17),35.8(C-18),69.6(C-19),79.4(C-20),73.3(C-21),17.1(C-22),96.8(C-1'),26.3(C-2'),24.3(C-3'),67.6(C-4'),77.3(C-5'),17.7(C-6').其理化性質(zhì)和波譜學(xué)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報道的數(shù)據(jù)吻合,鑒定為榴菌素B(見圖2(a)).

    化合物6 橙色針晶,APCI-MS:m/z 575[MH]-,表明其相對分子質(zhì)量為576.1H NMR(600MHz,ACETONE-d6)圖譜主要化學(xué)位移:5.13(1H,dd,J=3.0,1.8Hz,17-H),5.00(1H,q,J=6.6 Hz,15-H),4.82(1H,br s,1'-H),4.37(1H,m,3-H),4.14(1H,q,J=6.6 Hz,5'-H),4.05(1H,dd,J=7.8,1.2 Hz,19-H),3.81(1H,q,J=6.0 Hz,21-H),3.48(1H,br s,4'-H),2.83(1H,dd,J=19.6Hz,2a-H),2.77(1H,ddd,J=14.1,4.3,1.9Hz,4a-H),2.73(1H,dd,J=19.6Hz,2b-H),2.68(1H,ddd,J=14.4,7.8,3.0Hz,18a-H),2.11(1H,dd,J=18.6,5.1 Hz,4b-H),1.96(1H,m,3'a-H),1.81(1H,m,3'b-H),1.56(3H,d,J=6.6Hz,16-H),1.52(1H,被 δ 1.50 屏蔽,18b-H),1.50(1H,m,2'a-H),1.20(1H,m,2'b-H),1.17(3H,d,J=6.6 Hz,6'-H),0.94(3H,d,J=6.0Hz,22-H).13C NMR(150MHz,ACETONE-d6)圖譜主要化學(xué)位移:167.9(C-1),35.6(C-2),66.8(C-3),25.2(C-4),83.4(C-5),192.8(C-6),111.8(C-7),150.1(C-8,C-11),137.6(C-9),134.7(C-10),111.9(C-12),199.1(C-13),75.1(C-14),67.5(C-15),15.8(C-16),62.3(C-17),35.8(C-18),65.8(C-19),78.4(C-20),73.3(C-21),16.3(C-22),96.7(C-1'),25.9(C-2'),24.3(C-3'),65.6(C-4'),76.8(C-5'),17.3(C-6').其波譜學(xué)數(shù)據(jù)與化合 物 MM44785 基 本 相 同[12],因 此 鑒 定 為MM44785(見圖2(d)).

    化合物7 橙色針晶,APCI-MS:m/z 461[MH]-,m/z 443[M -H2O]-,表明其相對分子質(zhì)量為462.1H NMR(600 MHz,ACETONE-d6)圖譜主要化學(xué)位移:5.13(1H,dd,J=3.6,1.8 Hz,17-H),5.01(1H,q,J=6.6 Hz,15-H),4.37(1H,m,3-H),3.97(1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,19-H),3.74(1H,q,J=6.0Hz,21-H),2.83(1H,dd,J=19.6 Hz,2a-H),2.77(1H,ddd,J=14.6,4.3,1.9Hz,4a-H),2.73(1H,dd,J=19.6 Hz,2b-H),2.68(1H,ddd,J=14.4,7.8,3.6 Hz,18a-H),2.11(1H,dd,J=19.6,5.1Hz,4b-H),1.56(3H,d,J=6.6 Hz,16-H),1.46(1H,dt,J=14.4,1.8 Hz,18b-H),0.95(3H,d,J=6.0Hz,22-H).13C NMR(150 MHz,ACETONE-d6)圖譜主要化學(xué)位移:167.3(C-1),35.7(C-2),67.2(C-3),24.7(C-4),83.8(C-5),193.0(C-6),111.6(C-7),153.8(C-8),137.7(C-9),135.1(C-10),159.7(C-11),112.5(C-12),199.5(C-13),75.3(C-14),67.3(C-15),15.9(C-16),62.5(C-17),35.7(C-18),65.5(C-19),78.6(C-20),73.6(C-21),16.5(C-22).其相對分子質(zhì)量比化合物6少114,剛好是一個鼠李糖基的大小,其波譜學(xué)數(shù)據(jù)除缺失鼠李糖基相關(guān)信號外,其余幾乎與化合物6完全一致.因此,該化合物是化合物6的去鼠李糖基形式,即去鼠李糖基MM44785(見圖2(d)).

    3 結(jié)論

    粵藍(lán)鏈霉菌產(chǎn)藍(lán)色素的適合培養(yǎng)基是高氏合成一號培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基也可作為工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,優(yōu)化的培養(yǎng)條件為:接種量5%,培養(yǎng)溫度30℃,180r/min振動培養(yǎng)7 d.從粵藍(lán)鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離并鑒定出紫羅蘭藍(lán)色素的7個主要成分,分別為榴菌素,榴菌素B,醌茜蘭類色素Zg、Zgg,二氫Zg,MM44785和去鼠李糖基MM44785,其中二氫Zg和去鼠李糖基MM44785是兩個新的榴菌素相關(guān)化合物.

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