高效液相色譜法測(cè)定川東獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量

蔡興東，楊建平，黃 春，沈 力，李潤(rùn)琴，劉 丹，張樂(lè)星

(重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，重慶萬(wàn)州 404020)

高效液相色譜法測(cè)定川東獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量

蔡興東，楊建平，黃 春，沈 力，李潤(rùn)琴，劉 丹，張樂(lè)星

(重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，重慶萬(wàn)州 404020)

目的：建立川東獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜法，Crest C18（4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相：甲醇-水（25∶75），流速：1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，柱溫：25℃。結(jié)果：獐牙菜苦苷在0.4～2.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9），平均回收率為99.78%，RSD=1.86%（n=6）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好,可作為川東獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量測(cè)定方法。

川東獐牙菜；獐牙菜苦苷；含量測(cè)定

川東獐牙菜（Swertia davidi Franch.）又名水靈芝、魚(yú)膽草、青魚(yú)膽草、水黃連，為龍膽科獐芽菜屬植物川東獐牙菜的干燥全草?！端拇ㄊ≈兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》1987年版以魚(yú)膽草名收載，具有清熱解毒、利膽健胃等功效，民間常用于各種類(lèi)型肝炎及膽囊炎等的治療。有研究表明，川東獐牙菜的苦苷類(lèi)成分有明顯的抗腫瘤作用[1]，其提取物制成的注射劑對(duì)革蘭陽(yáng)性菌具有較強(qiáng)的抑制作用[2]。川東獐牙菜僅在長(zhǎng)江上游及其烏江支流一帶海拔130～170 m的河谷地帶生長(zhǎng)，三峽庫(kù)區(qū)蓄水175 m后，失去自然生長(zhǎng)條件成為瀕危藥用植物，有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了生藥學(xué)和引種栽培研究，現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)人工種植[3-6]。川東獐牙菜具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景，而其相關(guān)研究報(bào)道卻不多，為進(jìn)一步深入研究、開(kāi)發(fā)利用川東獐牙菜，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)川東獐牙菜中的有效成分之一獐牙菜苦苷含量進(jìn)行了測(cè)定，為川東獐牙菜的質(zhì)量控制提供了參考。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)內(nèi)容介紹如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津 LC-2010A高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器，BSA124S-CW型萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯）；MILLIQ BIOCEL超純水機(jī) （法國(guó)密理博公司）；KQ-250DA型數(shù)控超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

獐牙菜苦苷對(duì)照品（批號(hào)：09110401），購(gòu)于成都普思生物科技有限公司（純度＞98%）；川東獐牙菜藥材，購(gòu)于萬(wàn)州，經(jīng)重慶三峽中藥研究所沈力教授鑒定為龍膽科（Gentianaceae）獐牙菜屬植物川東獐牙菜（Swertia davidi Franch.）；甲醇為色譜純；水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Crest C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；甲醇-水（25∶75）為流動(dòng)相，流速為1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為25℃。

2.2 對(duì)照品溶液制備

取獐牙菜苦苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每毫升含0.1 mg的溶液，經(jīng)0.45 μm的濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 供試品溶液制備

稱(chēng)取經(jīng)干燥粉碎的川東獐牙菜樣品約1.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，精密稱(chēng)定重量，超聲處理50 min，放冷，補(bǔ)足甲醇量，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液1 ml，甲醇稀釋至10 ml，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液以，按上述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，考察系統(tǒng)適用性。HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取獐牙菜苦苷對(duì)照品溶液4、8、12、20 μl，注入色譜儀，測(cè)定峰面積積分值。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程：Y=6 355.8X-1 689.8（r=0.999 9），獐牙菜苦苷的線性范圍為0.4～2.0 μg。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液在0、2、4、8、12、24、48 h分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果基本一致，RSD=1.08%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 精密度試驗(yàn)

按上述色譜條件取獐牙菜苦苷對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積積分值，RSD=0.4%，表明精密度良好。

2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批川東獐牙菜藥材樣品5份，精密稱(chēng)定，依法測(cè)定含量，RSD=1.63%（n=5）。表明重現(xiàn)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

采用加樣法，取同一供試品6份，精密加入獐牙菜苦苷對(duì)照品溶液，分別依法測(cè)定獐牙菜苦苷含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.10 樣品含量測(cè)定

參照供試品溶液制備項(xiàng)下要求，制備樣品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液和樣品溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀中，依法測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算獐牙菜苦苷含量。3批樣品中獐牙菜苦苷含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 獐牙菜苦苷回收率試驗(yàn)（n=6）Tab.1 Recovery test of Swertiamarin（n=6）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.2 Content determination results of samples（n=3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

實(shí)驗(yàn)中曾參照文獻(xiàn)[7]采用甲醇-水（20∶80）為流動(dòng)相，獐牙菜苦苷保留時(shí)間較長(zhǎng)，約26 min，調(diào)整流動(dòng)相比例至甲醇-水為25∶75，獐牙菜苦苷于14.5 min左右出峰，與其他成分達(dá)基線分離，分離度大于1.5，且峰形對(duì)稱(chēng)尖銳。

3.2 提取條件的選擇

獐牙菜苦苷易溶于甲醇，因此采用甲醇作提取溶劑。實(shí)驗(yàn)中參照文獻(xiàn)[7-8]選取了超聲提取法對(duì)川東獐牙菜藥材樣品中的獐牙菜苦苷進(jìn)行提取，實(shí)驗(yàn)中分別在30、40、50、60 min考察了超聲提取時(shí)間對(duì)獐牙菜苦苷含量的影響，結(jié)果表明超聲處理50 min后提取液中獐牙菜苦苷含量不再增加，表明50 min已提取完全。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，對(duì)川東獐牙菜中獐牙菜苦苷進(jìn)行含量測(cè)定，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，供試品中獐牙菜苦苷得到了較好的分離，且無(wú)干擾；并經(jīng)方法學(xué)考察，本法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可以為川東獐牙菜的質(zhì)量控制提供參考，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用川東獐牙菜打下基礎(chǔ)。

[1]趙李劍,左澤乘,鄒洪波,等.川東獐牙菜苦苷類(lèi)成分的提取及體外抗腫瘤作用研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2006,12(5):62-64.

[2]劉士尋.川東獐牙菜對(duì)幾種菌株的抑制試驗(yàn)[J].甘肅畜牧獸醫(yī),2003,33 (3):18-19.

[3]付紹智,余甘霖,沈力.川東獐牙菜繁殖方法比較[J].中藥材,2002,25(9): 622-623.

[4]涂建雄.川東獐牙菜的生藥學(xué)研究[J].湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),1999,5(12):12.

[5]黃衡宇,李鸝,陳義光.川東獐牙菜的引種栽培研究[J].武漢植物學(xué)研究,2002,20(2):145-149.

[6]李濤,曹玉娟,趙敏慧.川東獐牙菜引種栽培研究[J].玉溪師范學(xué)院學(xué)報(bào),2006,22(9):94-98.

[7]胥秀英,唐春紅,鄭一敏,等.高效液相色譜法測(cè)定川東獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2003,34(5):475-476.

[8]夏從龍,劉光明,王胤.高效液相色譜法測(cè)定麗江獐牙菜中4種有效成分的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(5):598-601.

Determination of Swertiamarin in Swertia davidi Franch.by HPLC

CAI Xingdong,YANG Jianping,HUANG Chun,SHEN Li,LI Runqin,LIU Dan,ZHANG Lexing
(Chongqing Three Gorges Medicine School,Wanzhou 404020，China)

Objective:To establish a method for the determination of Swer-tiamarin in Swertia davidi Franch.by HPLC.Methods:High performance liquid chromatography was performed on C18column.The chromatographic conditions were as follows:methyl alcohol-water(25∶75)as mobile phase，flow rate being 1.0 ml/min,the detecting wavelength at 254 nm and column temperature being 25℃.Results:Swertiamarin had good linear relation within the range from 0.4 to 2.0 μg (r= 0.999 9).The average recovery was 99.78%with a RSD of 1.86%(n=6).Conclusion:This method is convenient,accurate, reproducible,and can be used for content determinaton of Swertiamarin in Swertia davidi Franch..

Swertia davidi Franch.;Swertiamarin;Content determination

R284.1

A

1673-7210（2011）02（b）-042-02

重慶市教育委員會(huì)科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目資助（No：KJ082102）。

蔡興東（1977.9-），四川資中人，碩士學(xué)歷，講師，研究方向?yàn)樘烊凰幬镅芯俊?/p>

楊建平（1955.10-），重慶忠縣人，病理學(xué)教授。

2010-12-14）