上海地區(qū)2006-2009年分離的大腸埃希菌O157特征分析研究＊

盛躍穎 ,陳 敏 ,陳洪友 ,姜 華 ,張 曦 ,吳 凡

腸出血性大腸埃希菌(EnterohemorrhagicEscherichia coli,EHEC)O157∶H7是一種能引起出血性結(jié)腸炎,溶血性尿毒綜合征(Hemolytic uremic syndrome,HUS)等嚴(yán)重并發(fā)癥的新型病原菌。我國(guó)自1986年首次報(bào)告 EHEC O157∶H7感染病例以來(lái)。國(guó)內(nèi)多個(gè)省市和地區(qū)陸續(xù)在腹瀉病患者、家畜家禽的糞便和食品中檢測(cè)出了 EHEC O157∶H7[1-2]。本實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)對(duì)上海地區(qū)從腹瀉病人、牛糞及食品中分離的玻片凝集初篩為E.coliO157的菌株進(jìn)行進(jìn)一步分子特征研究,了解不同來(lái)源的各菌株之間的關(guān)系,為流行病學(xué)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞 4株 EHEC O157∶H7標(biāo)準(zhǔn)菌種:編號(hào) G1329,G2534,來(lái)源于德國(guó),由南開(kāi)大學(xué)泰達(dá)生物技術(shù)學(xué)院提供;編號(hào)J4-92,J75-96,由日本京都大學(xué)竹田多惠博士惠贈(zèng)。9株E.coliO157∶H7分離株:編號(hào)4,17于2006年分離自上海地區(qū)的腹瀉病人;編號(hào)780,782,783,784,798,799于2008年分離自上海某區(qū)縣同一監(jiān)測(cè)點(diǎn)的牛糞;編號(hào)378為2009年分離自食品。2006-2009年分離的4株E.coliO157菌株:編號(hào)7,8,440,441,分離自牛糞。大腸埃希菌A TCC 25922作為陰性對(duì)照。沙門菌H9812作為PFGE實(shí)驗(yàn)的分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。Vero細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與儀器 菌株的生化鑒定采用法國(guó)BioMerieux公司的API 20E微量生化試劑條,血清學(xué)分型采用泰國(guó)S&A公司的大腸埃希菌O157診斷血清。PCR反應(yīng)液(Premix Taq○RVersion2.0),DL 1000 DNA marker,XbaⅠ內(nèi)切酶購(gòu)自大連寶生物有限公司;蛋白酶 K為 Promega公司產(chǎn)品;SeaKem Gold Agarose購(gòu)自美國(guó) Cambrex Bio Rockland公司;十二烷基肌氨酸鈉購(gòu)自 Sigma公司。試劑均在有效期內(nèi)使用。PCR擴(kuò)增儀,脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀(Chef-Mapper),凝膠成像儀(GEL Doc2000)均為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 菌體抗原基因、鞭毛抗原基因及主要毒力基因的聚合酶鏈反應(yīng)。

1.3.1 引物 檢測(cè)菌體抗原基因rfb O157,鞭毛抗原基因flic H7,志賀毒素 stx1、stx2,溶血素基因Hly,粘附抹平因子基因eaeA的引物序列見(jiàn)表1。

1.3.2 模板制備 采用熱裂解法,將待測(cè)菌株在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上37℃培養(yǎng)18～24 h,刮取2～3個(gè)菌落于200μL滅菌雙蒸水中混勻,100℃煮沸 15 min,直接用于PCR擴(kuò)增。

1.3.3 rfb O157和flic H7基因檢測(cè)的反應(yīng)條件PCR 反應(yīng)液25μL,引物4條,每條0.5μL(10 pmol/μL),模板DNA 4μL,滅菌雙蒸水 19μL 至總體積50μL。反應(yīng)程序:94℃5 min,模板DNA預(yù)變性,然后94℃30s,58℃30s,72℃1 min,35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5 min.以標(biāo)準(zhǔn)菌株 G2534作陽(yáng)性對(duì)照,大腸埃希菌A TCC25922作陰性對(duì)照。

1.3.4 stx1,stx2,hlyA,eaeA基因檢測(cè)的反應(yīng)條件 PCR反應(yīng)液 25μL,引物共 8條,其中引物VT1-F,V T1-R,V T2-F和 VT2-R每條 2μL(10 pmol/μL),EAE-F 和 EAE-R 每條 3μL(10 pmol/μL),Hly-F 和 Hly-R 每條 0.5μL(10 pmol/μL),模板DNA 4μL,滅菌雙蒸水10μL 至總體積50μL。反應(yīng)程序:94℃5 min,模板DNA預(yù)變性,然后94℃30sn,58℃30s,72℃1 min,35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5 min.以標(biāo)準(zhǔn)菌株 G2534作陽(yáng)性對(duì)照,大腸埃希菌ATCC25922作陰性對(duì)照。

1.4 細(xì)菌染色體DNA酶切片斷的PFGE分析實(shí)驗(yàn)步驟主要參照美國(guó)CDC病原菌分子分型監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)(PulseNet)的E.coliO157∶H7的PFGE標(biāo)準(zhǔn)化方法進(jìn)行操作。采用的限制性內(nèi)切酶為XbaⅠ。獲得的脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖譜采用BioNumerics軟件(Version 6.0)對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的染色體DNA酶切圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,并進(jìn)行聚類分析。

表1 E.coliO157的特異基因檢測(cè)引物序列及擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度Table 1 Primer sequences and lengths of PCRamplification products

1.5 Vero細(xì)胞毒性試驗(yàn) 選擇志賀毒素(stx1或stx2)PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的菌株進(jìn)行Vero細(xì)胞毒性試驗(yàn)。將待測(cè)菌株分別接種于5mL LB增菌液中37℃振蕩過(guò)夜后,使菌液濃度達(dá)到 108CFU/mL。吸取1mL增菌液用0.22μmL孔徑的濾膜過(guò)濾后,獲取過(guò)濾液備用。將Vero細(xì)胞包被到96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板,37℃5%CO2條件下培養(yǎng)24h,待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,替換新鮮Vero細(xì)胞培養(yǎng)液100μL。然后加入獲得過(guò)濾液100μL,培養(yǎng)48-72h后,觀察致死性細(xì)胞病變情況。以75%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變?yōu)橛^察終點(diǎn)。大腸埃希菌ATCC 25922作陰性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1生化鑒定 13株上海分離株經(jīng)API 20E鑒定為大腸埃希菌,除菌株7,8,440,441外,其余9株菌在24h內(nèi)不發(fā)酵山梨醇。

2.2 血清學(xué)分型及菌體抗原O157、鞭毛抗原 H7的PCR檢測(cè)結(jié)果 13株菌株均與O157因子診斷血清的玻片凝集試驗(yàn)均呈強(qiáng)凝集反應(yīng),且菌體抗原O157的特異基因檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性;其中9株菌株與H7因子診斷血清的試管凝集試驗(yàn)為陽(yáng)性,且鞭毛抗原H7的特異基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。結(jié)果見(jiàn)表2和圖1。

2.3 主要毒力基因PCR檢測(cè)及Vero細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果 9株菌株的毒力基因檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)陽(yáng)性,其Vero細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性。結(jié)果見(jiàn)表1、圖2和圖3。

表2 E.coliO157各菌株血清分型、基因檢測(cè)及 Vero細(xì)胞毒性結(jié)果Table 2 Summary of serotyping,PCR testing and vero cell cytotoxicity assay ofE.coliO157 strains

2.2菌細(xì)胞PFGE電泳圖譜的聚類分析 17株E.coliO157菌株(包括4株標(biāo)準(zhǔn)株)分為10個(gè)型別(E01～E10)。其中13株上海分離株共分了6個(gè)型別(E01,E04,E05,E08,E09,E10)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

3 討 論

腸出血性大腸埃希菌O157∶H7在世界各地包括中國(guó)都造成了不同規(guī)模的暴發(fā)流行,是全球公認(rèn)的公共衛(wèi)生問(wèn)題。牛是該病原菌的主要自然宿主。本試驗(yàn)中,對(duì)上海地區(qū)不同來(lái)源的大腸埃希菌O157進(jìn)行了表型分析與鑒定,包括生化鑒定和血清學(xué)分型;同時(shí)用分子生物學(xué)的方法,包括 PCR方法和PFGE方法分析了各菌株是否攜帶主要毒力因子及菌株間的相關(guān)性。

采用了多重PCR方法對(duì)13株分離株進(jìn)行了4個(gè)主要毒力基因(stx1,stx2,eaeA,hly)的檢測(cè),結(jié)果顯示其中有8株菌株(6株牛糞分離株和2株腹瀉患者分離株)的主要毒力基因型均為stx2+eaeA+hly,為目前國(guó)內(nèi)分離的EHEC O157∶H7主要毒力基因模式[7]。1株從食品中分離的E.coliO157∶H7,其毒力基因型為stx1+stx2+eaeA+hly,為上海地區(qū)首次從食品中分離到該菌,提示應(yīng)加強(qiáng)對(duì)食品中EHEC O157∶H7的監(jiān)測(cè)力度。

PFGE方法目前已是E.coliO157分子分型的常用方法[8]。應(yīng)用BioNumerics分析軟件對(duì)13株上海分離株的XbaⅠ酶切后電泳圖譜進(jìn)行識(shí)別分析,各菌株可出現(xiàn)17～21個(gè)酶切條帶,共分為6個(gè)型別。

從聚類圖可見(jiàn),從食品中分離的一株E.coliO157∶H7(編號(hào)378),除 stx2基因外,帶有 stx1基因,與同樣攜帶有stx1基因的德國(guó)分離株 G2534的PFGE圖譜最為接近。由于stx1和stx2基因都位于細(xì)菌染色體的原噬菌體上,因此是否攜帶該基因會(huì)改變菌株的酶切圖譜。可見(jiàn),在采用PFGE分型之前,先對(duì)菌株進(jìn)行毒力基因或其他特征基因的檢測(cè)是有必要的。結(jié)合這兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以更好地分析菌株間的相關(guān)性,對(duì)流行病學(xué)的溯源分析等提供了更全面的信息。

10株牛糞分離株中,2008年從同一地區(qū)分離的6株牛糞分離株(編號(hào)780,782,783,784,798,799),有5株屬于同一型別,編號(hào)為784菌株與其他菌株也呈高相關(guān),僅差異2個(gè)條帶。這6株牛糞分離株與2株日本分離株(編號(hào)J4-92,J75-96)的 PFGE圖譜相似度高,同源性達(dá)92%;而與具有相同毒力基因模式的2株病人糞便分離株(編號(hào)4,17)的PFGE圖譜存在明顯不同,提示本市不同來(lái)源的 EHEC O157∶H7菌株可能存在多種型別。另一方面由于攜帶該病原菌的家畜是潛在的傳染源,可通過(guò)多種途徑污染食品等造成該菌的散發(fā),甚至暴發(fā)性流行。上海地區(qū)從牛糞中檢出攜帶有志賀樣毒素的菌株,說(shuō)明應(yīng)加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物糞便及其他可疑傳染源的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè),更深入地進(jìn)行區(qū)域性的流行病學(xué)調(diào)查研究。

此外,另外4株從牛糞分離的E.coliO157菌株(編號(hào)7,8,440,441)根據(jù)酶切圖譜顯示的條帶數(shù)量和位置可以分為兩組,但這兩組圖譜與標(biāo)準(zhǔn)株和其他上海分離株的條帶差異大于7個(gè),可判定兩者互為不相關(guān)菌株[9]。結(jié)合這4株牛糞分離株的 H7鞭毛特異基因和主要毒力基因檢測(cè)結(jié)果都為陰性,說(shuō)明這4株菌不能被定義為EHEC O157∶H7。但此類菌株是否會(huì)存在其他毒力基因,需進(jìn)一步檢測(cè)研究。

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