人類白細(xì)胞介素10基因-592C/A多態(tài)性與SLE相關(guān)性研究

任小英 李 燕 任麗玲 王莉 武永康*

（1 成都市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610041；2 四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610041；3 成都市老年病醫(yī)院，四川 成都 611130；4 中國(guó)人民解放軍第452醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 成都 610041）

人類白細(xì)胞介素10基因-592C/A多態(tài)性與SLE相關(guān)性研究

任小英1李 燕2任麗玲3王莉4武永康2*

（1 成都市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610041；2 四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610041；3 成都市老年病醫(yī)院，四川 成都 611130；4 中國(guó)人民解放軍第452醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 成都 610041）

目的系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種復(fù)雜的與遺傳密切相關(guān)的免疫炎癥性自身免疫疾病。而人類白細(xì)胞介素10（human interleukin-10，IL-10）被認(rèn)為是體內(nèi)最重要的抑炎細(xì)胞因子，其對(duì)炎性反應(yīng)的調(diào)控起非常重要的作用，IL-10在SLE患者體內(nèi)顯著升高。本研究主要針對(duì)IL-10基因-592C/A多態(tài)性與SLE發(fā)病的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。方法抽取145例SLE患者和80例健康對(duì)照者全血標(biāo)本，提取患者DNA，采用PCR和酶切、電泳的方法得到IL-10基因-592C/A位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率。結(jié)果SLE患者IL-10基因-592C/A位點(diǎn)基因型分布和基因型頻率分布與健康對(duì)照者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論IL-10基因-592C/A多態(tài)性與SLE易感性無(wú)關(guān)。

IL-10；基因多態(tài)性；SNP；SLE

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種臨床上常見的、復(fù)雜的自身免疫性疾病，被稱為自身免疫性疾病的原型?；颊咄怀霰憩F(xiàn)為有自身抗體的產(chǎn)生并通過(guò)免疫復(fù)合物等途徑造成周身多系統(tǒng)、多器官都可受累。腎功能衰竭、感染、中樞神經(jīng)損傷是其死亡的主要原因，其病因、發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。目前普遍認(rèn)為是環(huán)境因素（毒物、飲食、感染等）作用于一定的遺傳背景的機(jī)體造成自身免疫損傷[1]。近年來(lái)雖有研究證實(shí)EB病毒[2]、吸煙和化學(xué)殺蟲劑等有害環(huán)境以及藥物[3]在SLE的發(fā)病過(guò)程中起一定作用，但普遍認(rèn)為遺傳因素起關(guān)鍵作用。SLE具有很強(qiáng)的遺傳傾向，有研究表明，SLE的同胞患病率是一般人群的29倍[4]，同卵雙生子發(fā)病一致率為24%～58%，異卵雙生子的發(fā)病一致率為2%～5%[5]，流行病學(xué)顯示：SLE患者一級(jí)親屬中的女性SLE患病率是2.64%，而正常人群為0.4%，SLE患者一級(jí)親屬中非SLE自身免疫性疾病發(fā)病率也明顯高于正常人群[6]。

人類SLE致病因素涉及到多種基因和基因組結(jié)構(gòu)的變化?；蚪MDNA隨著細(xì)胞的增值過(guò)程不斷被復(fù)制，其間DNA本身處于損傷和修復(fù)的動(dòng)態(tài)變化中，其中未被修復(fù)而保留的突變構(gòu)成了許多疾病的發(fā)病機(jī)制。大量存在于基因組的可遺傳變異，有些可成為疾病的直接原因。隨著人類基因組的最新發(fā)展及技術(shù)的出現(xiàn)，也為復(fù)雜特性的研究提供了新的工具，其中單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是人群遺傳多態(tài)性的主要表達(dá)形式之一。

單核苷酸多態(tài)性（SNP）是人基因組內(nèi)最廣泛的遺傳變異，它也是體現(xiàn)人群中個(gè)體差異的DNA序列變化中最基本和最常見的形式。SNP是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異而引起的DNA序列多態(tài)性，即基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，其中一種在群體中的頻率不小于1%，包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失，其在臨床醫(yī)學(xué)上主要應(yīng)用于疾病的易感基因定位、器官的移植及藥物基因組學(xué)等方面。人類絕大多數(shù)遺傳變異是由SNP所致[7]。由于SNP分布廣，數(shù)量多，遺傳特性穩(wěn)定，易于批量自動(dòng)化檢測(cè)。所以，SNP己經(jīng)成為第3代遺傳標(biāo)記，廣泛應(yīng)用與多基因疾病如人類腫瘤、自身免疫性疾病等相關(guān)基因的研究。多種遺傳基因與人類SLE相關(guān)，因此尋求SLE相關(guān)基因成為目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。目前己知基因有免疫球蛋白Fc受體ⅡA、ⅡB、ⅢA和ⅢB，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4，胰脫氧核糖核酸酶Ⅰ，程序性細(xì)胞死亡1，單核細(xì)胞趨化蛋白1，酪氨酸激酶-，Toll-樣受體9，干擾素調(diào)節(jié)因子5，蛋白酪氨酸磷酸酶22，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，甘露糖結(jié)合凝集素，骨橋蛋白（osteopontin，OPN）等[8-20]，通過(guò)基于基因組DNA序列變異的遺傳學(xué)分析，有望為人類揭開復(fù)雜性狀多基因疾病的分子機(jī)制。

近年來(lái)，白細(xì)胞介素10（interlenkin-10，IL-10）受到廣泛關(guān)注，被認(rèn)為是體內(nèi)最重要的抑炎細(xì)胞因子，對(duì)炎性反應(yīng)的調(diào)控起非常重要的作用。IL-10最初是由美國(guó)DNAX研究所Fiorentino在1989年發(fā)現(xiàn)鼠輔助性T細(xì)胞Th2亞型細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，能抑制Th1細(xì)胞株細(xì)胞因子RNA的轉(zhuǎn)錄，所以最初被稱為細(xì)胞因子合成抑制因子（cytokinesynthesis inhibitory factor，CSIF），同年命名為IL-10。人IL-10含178個(gè)氨基酸殘基，內(nèi)有18氨基酸信號(hào)序列，相對(duì)分子質(zhì)量為18.7×103。人IL-10基因定位于第1號(hào)染色體q31～32，其基因組包括5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。在轉(zhuǎn)錄起始部位上游-1082（G/A）、-819（C/T）、-592（C/A）處有3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)（IL-l0G和IL-10R，位于上游1.2kb和4kb處）[13,14]。研究表明，啟動(dòng)子多態(tài)性與IL-10表達(dá)水平有密切聯(lián)系，-1082G、-819C、-592C相對(duì)于-1082A、-819T、-592A為高表達(dá)等位基因[15]。本文擬對(duì)SLE患者IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)域-592A/C位點(diǎn)的多態(tài)性研究，以探討SLE的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 SLE患者組

選取2008年11月至2009年06月期間SLE確診患者145例，年齡13～73歲，平均年齡34歲，男女比例為18∶127。所有SLE患者均符合1997的美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)診斷和治療標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)所制定的分類標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 健康對(duì)照組

收集健康體檢者80例，年齡21～70歲，平均年齡39歲，男女比例為9∶71。經(jīng)詢問(wèn)病史、體格檢查和常規(guī)生化化驗(yàn)、心電圖及胸片等輔助檢查，確認(rèn)無(wú)器質(zhì)性疾病，且既往無(wú)風(fēng)濕病及其他自身免疫性疾病，近期無(wú)感染性疾病。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

全血基因組DNA快速提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；Taq DNA Polymerase（TIANGEN BIOTECH）；RsaI內(nèi)切酶（紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司）；引物；dNTP等。

1.2.2 主要儀器

Eppendorf高速離心機(jī)；基因擴(kuò)增儀；pharmacia biotech電泳儀；電泳槽；Epson掃描儀等。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

按試劑說(shuō)明書進(jìn)行提取。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

94℃反應(yīng)5min，94℃反應(yīng)35s→ 56℃反應(yīng)40s→ 72℃反應(yīng)50s→循環(huán)反應(yīng)上述步驟34次。1.3.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

1.3.3.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳

1.3.3.2 染色

①電泳結(jié)束后取出凝膠，放置到染色盤中。②加入0.3%的硝酸銀蓋過(guò)膠，放到搖床上染色反應(yīng)15min后用蒸餾水洗3次。③加2%NaON至蓋過(guò)膠，放到搖床上反應(yīng)15min，此時(shí)可以看到凝膠上顯示出清晰的條帶。④加少量冰醋酸終止顯色。

1.3.3.3 采圖

用掃描儀采圖并保存。

1.3.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切

①酶切體系配制（10μL）：水：7.8μL；10×NEB緩沖液：1μL；內(nèi)切酶：0.2μL；PCR產(chǎn)物：1μL。②酶切：把配制好的擴(kuò)增管放入37℃孵育6h。

1.3.5 酶切產(chǎn)物檢測(cè)

方法同PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)。

1.3.6 結(jié)果判讀

綜上所述，企業(yè)內(nèi)部控制的發(fā)展對(duì)是企業(yè)財(cái)務(wù)勝仗的保障兵，科學(xué)化提高電算化的管理水平更是是重中之重在建立現(xiàn)代化企業(yè)制度的同時(shí)，更能夠提高企業(yè)產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)能力。同時(shí)，要充分考慮我國(guó)內(nèi)外經(jīng)濟(jì)環(huán)境與企業(yè)實(shí)際情況，靈活把握管控的方式方法，力求摸索出一套完善靈活的成本管理和內(nèi)控體系模式。

①PCR產(chǎn)物電泳出現(xiàn)一條412bp的條帶。②酶切產(chǎn)物電泳出現(xiàn)三種情況：RsaⅠ內(nèi)切酶不能切割C等位基因，而A等位基因可以被切割成236bp和176bp兩個(gè)片段。

AA：電泳呈現(xiàn)兩個(gè)條帶——236bp和176bp；CC：電泳呈現(xiàn)一個(gè)條帶——412bp；AC：電泳呈現(xiàn)三個(gè)條帶——412bp，176bp和236bp。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.4.1 數(shù)據(jù)處理方法

①用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因頻率。②以χ2檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間基因頻率的顯著性檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有差異有顯著性。統(tǒng)計(jì)軟件：SPSS16.0。

1.4.2 Hardy-Weinberg平衡定律

計(jì)算各人群中的各等位基因頻率，采用Hardy-Weinberg平衡定律，判斷對(duì)照組和試驗(yàn)組等位基因是否已經(jīng)達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性才可以進(jìn)一步進(jìn)行兩組間的卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果

SLE患者組及健康對(duì)照組Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

P＞0.05，不能證明觀測(cè)值和期望值兩組數(shù)據(jù)有明顯差異，所以，符合Hardy-Weinberg平衡定律，樣本具有群體代表性。

2.2 PCR結(jié)果

PCR完成后，健康對(duì)照組產(chǎn)物電泳于400～500bp之間得到一條清晰的條帶，SLE試驗(yàn)組于400～500bp之間得到一條清晰的條帶，空白對(duì)照全程未查見條帶。結(jié)果如圖1所示。

注：1-3為SLE患者組，4-5為空白對(duì)照，6、8為健康對(duì)照組，7為marker；a為600bp，b為500bp，c為400bp d為300bp；A、B、C、D為412bp

注：1～4為SLE患者組結(jié)果，5-8為健康對(duì)照組結(jié)果，9-10為空白對(duì)照，11為marker；a為600bp，b為500bp，c為400bp，d為300bp，e為200bp；A為412bp，B為236bp，C為176bp；1、2、6、8為AA基因型，3、5為AC基因型，4、7為CC基因型

2.3 酶切結(jié)果

酶切完成后，電泳得到三種不同的圖像結(jié)果，籍此可以分為3種基因型，即AA、CC和AC。3種不同的基因型電泳圖如圖2所示。

2.4 基因型分布結(jié)果

根據(jù)酶切結(jié)果電泳圖，基因型分布結(jié)果見表2。

表2 基因型分布結(jié)果

IL-10基因-592C/A位點(diǎn)的基因型分布（AA/AC/CC）在SLE患者組（46.9%，38.6%，14.5%）和健康對(duì)照組（37.5%，47.5%，15.0%）中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 基因頻率分布結(jié)果

表3 基因頻率分布結(jié)果

等位基因頻率在SLE患者組（A66.21%，C33.79%）和健康對(duì)照組（A61.25%，C38.75%）中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在lpr小鼠，由于Fas基因突變，細(xì)胞凋亡受到抑制，一些自身反應(yīng)性細(xì)胞保留下來(lái)，可以促進(jìn)自身抗體的產(chǎn)生，此即所謂狼瘡素質(zhì)。具有這種素質(zhì)的個(gè)體，對(duì)狼瘡易感，結(jié)合體外環(huán)境的誘發(fā)因素，在細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用下，多克隆B細(xì)胞活化，形成一種狼瘡環(huán)境并逐漸發(fā)展，引起機(jī)體一系列的免疫調(diào)節(jié)紊亂，表現(xiàn)為疾病狀態(tài)。在此狼瘡環(huán)境形成的過(guò)程中，細(xì)胞因子扮演著舉足輕重的角色，尤以IL-10為著。人們發(fā)現(xiàn)體內(nèi)IL-10水平的不同會(huì)導(dǎo)致個(gè)體對(duì)某些疾病的易感性、發(fā)病年齡及疾病嚴(yán)重程度的不同。孿生胎家系研究表明，IL-10的分泌水平75%是由遺傳決定的，而且主要受轉(zhuǎn)錄水平的控制。單核苷酸多態(tài)性是最常見的DNA序列多態(tài)性，21世紀(jì)初以來(lái)，人們對(duì)一單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了廣泛研究。在整個(gè)IL-10基因上，從5’非翻譯區(qū)的啟動(dòng)子序列到3’非翻譯區(qū)存在著大量的SNP位點(diǎn)。其中啟動(dòng)子區(qū)域-108、-819、-592位置的SNP是研究的熱點(diǎn)。啟動(dòng)子負(fù)責(zé)與調(diào)節(jié)基因表達(dá)調(diào)控的因子相結(jié)合，其堿基的改變會(huì)直接影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

近年來(lái)，人們對(duì)不同的SNP或單體型與疾病的易感性和嚴(yán)重性之間的聯(lián)系進(jìn)行了廣泛研究。Eskdale等[21]研究發(fā)現(xiàn)，高加索人群中IL-10的基因多態(tài)性與SLE相關(guān)。Gibson等[22]也發(fā)現(xiàn)非裔美國(guó)人群中IL-10啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性與SLE相關(guān)。Chen等[23]通過(guò)檢測(cè)IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)域3個(gè)SNPs-1082、-819、-592的基因型和單倍型發(fā)現(xiàn)：3個(gè)SNPs的單倍型在SLE患者和正常人中差異有顯著性。王美美等[24]研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌Th2型細(xì)胞因子IL-10的水平較正常人增高，且增高程度與SLE病情活動(dòng)性相關(guān)。黎莉等[25]對(duì)未經(jīng)藥物治療的初發(fā)SLE患者和正常人的IL–10 mRNA及其受體表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，初發(fā)SLE患者IL-10mRNA與正常人無(wú)明顯差異，但I(xiàn)L-10R表達(dá)明顯升高。Shen等[23]研究發(fā)現(xiàn)：中國(guó)SLE患者中IL-10G138bp等位基因頻率較正常人群有顯著差異，對(duì)單一位點(diǎn)運(yùn)用傳遞不平衡檢驗(yàn)分析證實(shí)IL-10G138bp等位基因優(yōu)先傳遞給受累子代。上述結(jié)果均提示IL-10基因是SLE重要的易感基因。

本文就IL-10基因-592C/A多態(tài)性與SLE易感性之間的關(guān)系展開研究，選取145例SLE患者和80例健康對(duì)照者的全血標(biāo)本，提取基因組DNA，采用SNP的方法，分析基因型，用卡方檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢驗(yàn)得出SLE試驗(yàn)組（AA 46.9%：AC 38.6%：CC 14.5%）和對(duì)照組（AA 37.5%：AC 47.5%：CC 15.0%）基因型無(wú)顯著性差異（P＞0.05），基因頻率試驗(yàn)組（A 66.21%：C 33.79%）和對(duì)照組（A 61.25%：C 38.75%）也無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。本研究結(jié)果顯示，IL-10-592C/A的多態(tài)性在SLE患者與健康對(duì)照者之間尚未發(fā)現(xiàn)顯著性差異，表明IL-10-592C/A的多態(tài)性與SLE易感性可能無(wú)關(guān)，但它們與其他多個(gè)基因位點(diǎn)的連鎖可能是導(dǎo)致SLE發(fā)病的原始基因缺陷之一。因此，IL-10與其他多個(gè)基因位點(diǎn)的連鎖是進(jìn)一步研究關(guān)注的重點(diǎn)。

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The Research of Genetic Association of Interleukin-10 Polymorphisms with Systemic Lupus Erythematosus

REN Xiao-ying1, LI Yan2, REN Li-lin3, WANG Li4, WU Yong-kang2*
(1 Department of Laboratory, Chengdu First People's Hospital, Chengdu 610041, China;
2 Department of Experimental Medicine, Huaxi Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, China;
3 Geriatrics Hospital of Chengdu, Chengdu 610041, China;
4 Department of Gynecology and Obstetrics, 452 Hospital of PLA, Chengdu 610041, China)

ObjectiveTo investigate the relationship between the polymorphism of IL-10 gene-592C/A and susceptivity of SLE.MethodsThe whole blood specimens of 145 SLE patients and 80 healthy control subjects were collected. All samples were extracted genomic DNA, got the distribution of IL-10 gene-592C/A polymorphism by using PCR, digested by restriction enzyme and electrophoresised.ResultsNo signifi cantly difference was found in IL-10 gene-592 C/A polymorphism between SLE patients and healthy controls (P＞0.05).ConclusionIL-10 gene-592 C/A polymorphism have no association with susceptibility of SLE.

IL-10; Gene polymorphism; SNP; Systemic lupus erythematosus

R593.24

B

1671-8194（2011）04-0024-03

*通訊作者：E-mail: vipwyk@163.com