家蠅抗菌物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)后的電泳分析＊

許兵紅,曾莉萍,董衛(wèi)華

許多昆蟲在受到外界誘導(dǎo)時(shí),能迅速產(chǎn)生一些體液免疫因子,如凝集素、溶菌酶、抗菌蛋白及抗菌肽,這些物質(zhì)主要是抗菌肽對(duì)細(xì)菌、某些真菌、病毒、原蟲有特殊殺傷或抑制作用。目前已有多種昆蟲的抗菌基因被誘導(dǎo)表達(dá),研究主要集中在鱗翅目和雙翅目昆蟲[1-5]。我們對(duì)絲光綠蠅(L ucilia sericata)[6-7]和家蠅(Musca domestica)[8-9]的抗菌物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)研究后,又對(duì)家蠅抗菌物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)后的電泳分離進(jìn)行了探討,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 昆蟲及飼養(yǎng) 供試驗(yàn)用的家蠅由本實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖,幼蟲生長(zhǎng)條件為:溫度26℃、相對(duì)濕度75%,光照采用60w白熾燈12h/d,幼蟲飼料各組分比例如下:麥麩600g,魚粉100g,牛奶粉 40g,酵母粉8g,蛋白胨15g,水1 500mL。

1.2 應(yīng)試菌種 溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)由本實(shí)驗(yàn)室提供,使用前將凍存的菌種復(fù)蘇,接種到固體培養(yǎng)基上,37℃恒溫培養(yǎng)16～18h備用。

1.3 誘導(dǎo) 取室內(nèi)飼養(yǎng)的家蠅3齡幼蟲(幼蟲孵出第3d),用2號(hào)昆蟲針針刺體壁誘導(dǎo),每蟲1針,處理后置于幼蟲飼料罐中飼養(yǎng)。

1.4 血淋巴收集 經(jīng)針刺誘導(dǎo)處理后第48h,收集存活的幼蟲,用0～4℃冷水反復(fù)沖洗,再用無(wú)菌雙蒸水沖洗3次,濾紙吸干蟲體表面水分,剪去頭部收集血淋巴于1.5mL離心管中,10 000r/min(6.64×103g,r=5.94cm)離心10min,取上清液備用,或置于-20℃冰箱保存。

1.5 抑菌活力測(cè)定 抑菌活力測(cè)定采用平板濾紙片法,濾紙片直徑6mm。固體培養(yǎng)基配比如下:蛋白胨 10g、牛肉膏 3g、NaCl 5g、瓊脂 20g,加雙蒸水至1 000mL,調(diào)p H至7.2,每個(gè)直徑7.5cm培養(yǎng)皿加入12mL培養(yǎng)基制成平板備用。細(xì)菌復(fù)蘇培養(yǎng)后,取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期細(xì)菌配成6×108cells/mL菌液,涂于平板上,將濾紙片加7μL血淋巴樣品,37℃培養(yǎng)24h后測(cè)量記錄抑菌環(huán)直徑。

1.6 針刺的誘導(dǎo)效果實(shí)驗(yàn) 提取家蠅幼蟲經(jīng)針刺誘導(dǎo)48h后的血淋巴,觀察記錄其對(duì)溶壁微球菌的抑菌效果,以未經(jīng)誘導(dǎo)正常飼養(yǎng)的家蠅幼蟲的血淋巴為對(duì)照,每組重復(fù)3次。

1.7 熱處理去雜蛋白效果和去雜蛋白后的抑菌效果實(shí)驗(yàn) 提取家蠅誘導(dǎo)后48h的血淋巴,1.5mL離心管加樣 200μL,分別置于 100℃水浴 10s、30s、1min、3min、5min、和 80℃水浴 30s、1min、3min、5min處理后,加雙蒸水 100μL,混勻后,10 000r/min離心10min去除沉淀,取上清,每組分別取7μL用于平板實(shí)驗(yàn),觀察不同溫度處理不同時(shí)間的去雜蛋白效果和去雜蛋白后對(duì)溶壁微球菌的抑菌效果。

1.8 電泳分析 經(jīng)誘導(dǎo)后 48h的血淋巴,經(jīng)100℃、80℃水浴熱處理不同時(shí)間后,取血淋巴離心上清,采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),10%分離膠,3%濃縮膠,樣品加樣20μL,觀察各樣品的電泳行為。

2 結(jié) 果

2.1 針刺的誘導(dǎo)效果 家蠅幼蟲經(jīng)針刺體壁處理后48h,提取的血淋巴對(duì)溶壁微球菌有明顯的抑菌活性,3次重復(fù)的抑菌環(huán)直徑分別為24、23和23 mm,而對(duì)照組亦有抑菌環(huán),但環(huán)小,僅為12 mm。

2.2 80℃高溫處理后的抑菌效果 見表1。

圖1 80℃處理不同時(shí)間后對(duì)溶壁微球菌的抑菌效果Fig.1 The antibacterial effect of hemolymph after being bathed at 80℃againstM.lysodeikticus

表1 80℃處理不同時(shí)間后對(duì)溶壁微球菌的抑菌環(huán)直徑(mm)Table 1 The antibacterial ring diameters(in mm)of hemolymph after being bathed at 80℃againstM.lysodeikticus

2.3 100℃高溫處理后的抑菌效果 見表2。

表2 100℃處理不同時(shí)間后對(duì)溶壁微球菌的抑菌環(huán)直徑(mm)Table 2 The antibacterial ring diameters(in mm)of hemolymph after being bathed at 100℃againstM.lysodeikticus

圖2 100℃處理不同時(shí)間后對(duì)溶壁微球菌的抑菌效果Fig.2 The antibacterial effect of hemolymph after being bathed at 100℃againstM.lysodeikticus

2.4 電泳分析 見圖3。

3 討 論

昆蟲抗菌基因的表達(dá)產(chǎn)物有溶菌酶、抗菌蛋白和抗菌肽,其中,溶菌酶和抗菌蛋白只起輔助作用,抗菌肽是主要的抗菌物質(zhì),對(duì)家蠅抗菌物質(zhì)的誘導(dǎo)雖有較多的報(bào)道,但經(jīng)加熱處理后去除變性蛋白后的抑菌活性以及電泳分析尚未見報(bào)道。

圖3 電泳圖譜Fig.3 Polyacrylamide gel electrophoresis1:80℃30s;2:1min;3:3min;4:5min;5:100℃5min;6:3min;7:1min;8:30s;9:10s

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,家蠅幼蟲經(jīng)針刺誘導(dǎo)后,其血淋巴對(duì)溶壁微球菌有明顯的抑菌環(huán)產(chǎn)生,對(duì)照組對(duì)溶壁微球菌雖然也有抑菌環(huán)產(chǎn)生,但明顯小于誘導(dǎo)組。提示針刺體壁可誘導(dǎo)家蠅幼蟲體內(nèi)產(chǎn)生抗菌物質(zhì)。

家蠅幼蟲血淋巴含大量的蛋白成分,需進(jìn)行預(yù)處理去除雜蛋白才易于分離,本實(shí)驗(yàn)采用了熱處理使蛋白變性離心去除的方法。100℃處理血淋巴時(shí),經(jīng)30s即變性,處理30s～5min等不同的時(shí)間后,離心可去掉大量的蛋白沉淀,且隨處理時(shí)間延長(zhǎng),離心去掉的變性蛋白增多。100℃水浴30s、1min后,其上清對(duì)溶壁微球菌仍有抗菌活性,100℃處理3min和5min后觀察不到明顯的抑菌環(huán),可見100℃處理時(shí)抗菌活性喪失較快,可能抗菌肽也隨之變性被離心去掉。80℃水浴30s后血淋巴并沒(méi)有蛋白變性發(fā)生,水浴1min后開始有蛋白變性發(fā)生,離心可去掉變性蛋白,水浴3min和5min后蛋白變性明顯,離心可去掉大量的變性蛋白。且經(jīng)80℃處理不同時(shí)間的上清均有明顯的抑菌活性,隨處理時(shí)間的延長(zhǎng),抗菌活性喪失較慢?？梢?抗菌肽誘導(dǎo)表達(dá)后提取的血淋巴,采用80℃處理30s,離心不能去除其血淋巴中的雜蛋白,雖然其上清抑菌活性強(qiáng),但電泳時(shí)由于血淋巴蛋白太多,分離效果不明顯(圖3中第1電泳道)。采用80℃處理1min左右后離心可去除大量的血淋巴雜蛋白,而且上清的抑菌活性保持較好,電泳分離效果比較清晰(圖3中第2電泳道)。采用80℃處理3min和5min后離心可去除更多的血淋巴雜蛋白,但上清的抑菌活性明顯減弱(表2)。提示純化前血淋巴預(yù)處理宜采用80℃水浴1min后離心去掉變性蛋白的方法。經(jīng)100℃水浴熱處理3min和5min的血淋巴上清與其他7個(gè)熱處理樣品在蛋白電泳區(qū)帶上也有明顯的差異,100℃處理3min和5min的血淋巴上清對(duì)溶壁微球菌無(wú)明顯的抑菌環(huán)產(chǎn)生,電泳圖譜也比其他處理組少2個(gè)明顯的區(qū)帶,此2條差異區(qū)帶可能為抗菌肽組份。

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