登革3型病毒義烏流行株免疫原性研究＊

顧 雯,金 聰,張 碩,張全福,李建東 ,杭小同 ,王 芹,李 川,梁米芳,李德新

登革病毒(dengue viruses,DENV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus),是一類嚴重危害人類健康的蟲媒病毒。據(jù)統(tǒng)計,全世界有超過25億的人口處于登革病毒的威脅之中,登革病毒感染已經成為嚴重的世界性公共衛(wèi)生問題[1]。登革病毒根據(jù)抗原性不同分為4個血清型(DENV1～4),不同血清型刺激機體產生無保護性作用的交叉抗體及ADE作用,給疫苗的研制帶來了極大的挑戰(zhàn),目前全世界范圍內尚無被批準的安全有效的疫苗。

登革病毒為單正鏈RNA病毒,基因組長約ll kb,含單一開放讀碼框,依次編碼3種結構蛋白(C、prM和 E)和7種非結構蛋白(NSl、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和 NS5)[2]。其中 E蛋白為DENV的主要包膜糖蛋白,是重要的抗原成份,也是登革病毒分型的依據(jù)。prM蛋白是M蛋白的前體,是形成病毒顆粒的重要膜蛋白并且有助于 E蛋白結構的穩(wěn)定,NS1蛋白是登革病毒重要的非結構蛋白。

2009年7月,浙江省義烏市暴發(fā)了登革熱疫情,經實驗室診斷為登革3型病毒感染所致[3]。本研究對2009年登革3型病毒義烏流行株進行E基因及NS1基因的系統(tǒng)進化分析,構建該流行株prM/E基因重組質粒,獲得分泌表達的E蛋白并對其免疫原性進行初步研究,為登革病毒診斷抗原的制備及登革疫苗的研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、毒株及抗體 293T細胞及BHK-21細胞由美國ATCC引進;DENV-3義烏分離株由浙江省疾控中心惠贈;DENV1-4型國際標準株(DENV-1 Hawaii株,DENV-2 NGC株,DENV-3 H87株及DENV-4 H241株)由本室保存。FITC標記的抗兔IgG抗體購自Sigma公司;HRP標記的抗兔IgG抗體購自Snata Cruz公司;DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清、DENV 1-4 EIII蛋白(分別表達DENV1-4國際標準株的EⅢ蛋白)由本室制備。

1.2 序列測定及系統(tǒng)進化分析 病毒RNA提取采用德國Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini kit,逆轉錄為cDNA后利用設計的28對引物擴增全基因組相應區(qū)段,序列測定后經拼接獲得全基因組序列。利用MEGA4將其與 GenBank中檢索到的其它14株登革3型病毒進行E及NS1區(qū)段核苷酸及氨基酸序列比對和同源性分析,Neighbor-joining(NJ)法建立系統(tǒng)發(fā)生樹,并用Bootstrap值為1 000評價系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.3 E蛋白的分泌表達 設計引物擴增DENV-3義烏分離株prM/E基因,通過融合 PCR方法在prM基因前添加一段來源于乙腦病毒的信號肽序列并將E基因C端的20%區(qū)域替換為乙腦病毒相應序列?；蚱谓汵 heI、NotI雙酶切后克隆至pcDNA5/FRT載體中,重組質粒命名為J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5。利用羅氏公司 Fu-GENE HD Transfection Reagent轉染試劑將該質粒轉染293T細胞,于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集上清。IFA及Western Blot方法分別檢測E蛋白在胞內的表達及胞外的分泌情況,以DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清(1∶200稀釋)及登革病人血清(1∶50稀釋)為一抗,FITC標記的抗兔IgG(1∶100稀釋)或 HRP標記的羊抗兔 IgG抗體 (1∶3 000稀釋)為二抗,按常規(guī) IFA及 Western Blot操作步驟進行檢測。

1.4 分泌性E蛋白的免疫原性研究

1.4.1 BALB/c小鼠免疫實驗 將 4-6w齡BALB/c雌性小鼠(由中國協(xié)和醫(yī)科大學實驗動物研究所提供)隨機分為 2組(5只/組),即實驗組(DENV-3 YW E蛋白組)及對照組(PBS組)。蔗糖密度梯度離心純化后的DENV-3 E蛋白及PBS分別與等體積的弗氏佐劑(初次免疫為弗氏完全佐劑,加強免疫為弗氏不完全佐劑)充分乳化后于第0、14、28d進行腹腔接種,免疫劑量為 100μg/只。末次免疫兩周后小鼠摘除眼球取血,分離血清備用。

1.4.2 ELISA檢測血清抗DENV 1-4 EIII蛋白抗體 以原核表達純化的DENV 1-4型EⅢ蛋白為抗原包被酶標板。每只小鼠血清從1∶50起作2倍系列稀釋,37℃孵育1h。加入1∶1 000稀釋的 HRP標記抗鼠IgG,37℃1h,顯色并終止。酶標儀檢測吸光度A450值。以PBS組各稀釋度A450值為陰性對照,根據(jù)Cutoff為 P/N>2.1的標準,選擇符合該標準的最大稀釋度作為每份血清的滴度并進行對數(shù)轉換。

1.4.3 微量細胞病變中和試驗檢測血清中和活性將BHK-21細胞傳代至96孔板,待細胞長至單層。將滅活后的血清從1∶5起作2倍系列稀釋,分別與100TCID50的DENV1-4病毒國際標準株按1∶1混合,37℃溫育1h后加入細胞表面,每個稀釋度作4個復孔。37℃,5%CO2培養(yǎng),7d后觀察細胞病變。以4個復孔均不出現(xiàn)可觀察到的細胞病變的血清稀釋度作為抗體中和效價。

2 結 果

2.1 DENV-3義烏分離株全基因組序列測定及系統(tǒng)進化分析 登革3型病毒義烏分離株基因組全長共10,685nt,含單一的開放讀碼框(95-10 267 nt),共編碼3391個氨基酸。利用登革病毒主要結構蛋白E及非結構蛋白NS1的核苷酸和氨基酸序列分別建樹,結果見圖1。義烏分離株屬于登革3型病毒亞型 Ⅲ,與 2009年廣州 GZ1D3株 (GB:GU363549)相似度最高,E基因、NS1基因核苷酸同源性分別為99.7%、99.4%,氨基酸同源性分別為99.8%、99.1%;與 2003年印度 GWL-25株(GB:A Y770511)E基因、NS1基因核苷酸同源性分別為 98.8%、98.5%,氨基酸同源性分別為99.8%、99.1%。與同分為亞型Ⅰ的國際標準株H87株及中國80-2株核苷酸差異大于5%,氨基酸差異為3%。

2.2 DENV-3義烏分離株 E蛋白的分泌表達J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5轉染293T細胞后,利用IFA檢測胞內表達情況,結果如圖2所示,分別以DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清及登革病人血清為一抗,胞內均可檢測到熒光顆粒,同時轉染pcDNA5/FRT載體的細胞中未見熒光,說明DENV-3 E蛋白在293T細胞內得到特異表達。利用Western blot檢測E蛋白在上清中的分泌情況,結果如圖3所示,分別以DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清及登革病人血清為一抗,J ESS-ywD3prM/E397 J EV-pcDNA5轉染上清在60kD處均可見明顯E蛋白目的條帶,同時轉染pcDNA5/FRT載體的上清中未見目的蛋白的分泌表達。

圖1 登革3型病毒系統(tǒng)發(fā)生樹A:E基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹;B:E蛋白氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹;C:NS1基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹;D:NS1蛋白氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.1 DENV-3 phylogenetic treesA:Phylogenetic tree based on E nucleotide sequences;B:Phylogenetic tree based on E amino acid sequences;C:Phylogenetic tree based on NS1 nucleotide sequences;D:Phylogenetic tree based on NS1 amino acid sequences

圖2 IFA檢測重組質粒在293T細胞中的表達A,C:J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5轉染 293T細胞;B,D:pcDNA5/FRT載體轉染293T細胞;A,B:DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清為抗體檢測;C,D:登革病人血清為抗體檢測Fig.2 Immunofluorescence assay of E protein expression in 293T cellA,C:293T cells transfected with J ESS-ywD3prM/E-pcDNA5;B,D:293T cells transfected with pcDNA5/FRT;A,B:E protein detected by DENV-3 EⅢrabbit immune serum;C,D:E protein detected by dengue patient serum

圖3 Western Blot檢測 E蛋白分泌表達M:蛋白預染Marker;A:陰性對照;B:DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清為抗體檢測J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5轉染上清;C:登革病人血清血清為抗體檢測J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5轉染上清Fig.3 Western blot analysis of extracellular E proteinM:PageRuler Prestained Protein Ladder;A:Negative control;B:J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5 transfection supernatants detected by DENV-3 EⅢrabbit immune serum;C:J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5 transfection supernatants detected by dengue patient serum

2.3 DENV-3義烏分離株分泌性E蛋白的免疫原性測定 純化的DENV-3義烏分離株分泌性 E蛋白免疫小鼠后運用 ELISA方法檢測抗四個型別登革病毒 EIII蛋白的 IgG抗體滴度,結果如圖4所示。分泌性E蛋白刺激小鼠產生的抗體可以分別與四個型別登革病毒的 EIII蛋白反應,其中針對DENV-3 EIII蛋白抗體滴度可達1∶1 400,與抗其他三個型別EIII蛋白的抗體水平有顯著性差異(P<0.05)。其余各組間均無統(tǒng)計學差異。微量細胞病變中和試驗檢結果如表1所示,DENV-3義烏分離株分泌性E蛋白能夠誘導小鼠產生一定水平的抗登革3型病毒的中和抗體,中和滴度明顯高于PBS對照組(P<0.05),但DENV-3義烏分離株分泌性E蛋白誘導小鼠產生的抗體并不能有效的中和其他3個型別的登革病毒。

3 討 論

圖4 ELISA檢測小鼠血清IgG抗體滴度＊表示該組與其他各組均存在統(tǒng)計學差異Fig.4 Mouse serum IgGantibody titer identified by ELISA＊Indicates significant differences with other groups

表1 免疫小鼠血清中和抗體檢測Table1 Neutralizing antibody titers of immunized mice

本研究利用分子流行病學方法,對2009年9月浙江省義烏市暴發(fā)流行的登革毒株進行系統(tǒng)進化分析,結果顯示該株病毒屬于登革3型病毒亞型Ⅲ[4],且與廣州2009年流行株同源性最高,提示浙江省義烏市所流行的登革3型病毒可能與廣州 GZ1D3來自于同一進化源頭,此源頭可能為2003年印度流行的GWL-25株。考慮此次義烏登革病毒流行的毒株可能來源于印度,從而引起2009年廣州和浙江義烏的登革3型病毒的流行。真正的輸入性流行情況有待進一步的流行病學資料加以證實。

E蛋白是黃病毒屬病毒重要的結構蛋白,能夠誘導機體產生保護性體液免疫和細胞免疫反應。E蛋白的表達研究有利于病毒診斷及疫苗研究的發(fā)展。中和抗體是抵抗登革病毒感染的關鍵,自然狀態(tài)下感染登革病毒會產生較高滴度的抗同型病毒的中和抗體,同時產生具有與其他三個血清型存在交叉反應的但無中和活性的抗體[5]。本研究通過對登革3型病毒義烏分離株prM/E基因進行改造,在哺乳動物細胞中獲得了分泌表達的 E蛋白,可與登革病人血清發(fā)生特異性免疫反應。將 E蛋白免疫BALB/c小鼠并測定其誘導的體液免疫反應,結果顯示登革3型病毒分泌性 E蛋白可刺激小鼠產生針對DENV1-4 EIII蛋白的IgG抗體,但僅與登革3型病毒具有中和活性。該研究結果為登革診斷抗原的制備及登革疫苗的研究奠定了基礎。

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