周圍血清P0蛋白抗體表達(dá)對(duì)快速進(jìn)展性自身免疫性內(nèi)耳病和梅尼埃病的診斷價(jià)值*

張治華 黃琦 楊軍 汪照炎 吳皓

自身免疫性內(nèi)耳病(autoimmune inner ear diseases，AIED)的特征為病程達(dá)數(shù)周或數(shù)月，雙側(cè)不對(duì)稱或單側(cè)快速進(jìn)展性、波動(dòng)性感音神經(jīng)性聽力下降，可伴平衡功能失調(diào)。如早期診斷和治療，可有效控制和逆轉(zhuǎn)其聽力下降癥狀[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2]，梅尼埃病(特別是雙側(cè))、遺傳性聾也可能因自身免疫反應(yīng)致耳蝸、前庭功能障礙而引發(fā)。

雖然AIED發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，但已發(fā)現(xiàn)多種抗原與其相關(guān)，其中髓鞘P0蛋白(myelin protein zero, MPZ)因與周圍神經(jīng)病關(guān)系密切而受到關(guān)注[3]。MPZ是一種分子量為30 KD的糖蛋白，屬于免疫球蛋白基因超家族，分布于哺乳動(dòng)物周圍神經(jīng)系統(tǒng)Schwann細(xì)胞膜上及內(nèi)耳蝸軸的聽神經(jīng)纖維和螺旋神經(jīng)節(jié)，是周圍神經(jīng)髓鞘的主要結(jié)構(gòu)成分，功能上促神經(jīng)細(xì)胞生長、影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等，也可作為抗原與自身免疫性內(nèi)耳病患者自身抗體結(jié)合而產(chǎn)生免疫應(yīng)答，使神經(jīng)產(chǎn)生脫髓鞘病變。

針對(duì)AIED診斷缺乏明確實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的難題，本研究旨在通過檢測快速進(jìn)展性AIED和梅尼埃病患者周圍血清MPZ抗體的表達(dá)，初步探討周圍血清MPZ抗體水平對(duì)此類疾病的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2009年1月至2010年3月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科門診就診的AIED患者共40例(研究組)為研究對(duì)象，其中，快速進(jìn)展性AIED 14例(35%)，梅尼埃病11例(27.5%)，遺傳性聾15例(37.5%)。男17例，女23例，年齡6～52歲，平均27.33±16.29 歲。選取其他自身免疫性疾病40例作為對(duì)照組，男22例，女18例，年齡15～46歲，平均25.41±11.27歲。

病例入選和剔除標(biāo)準(zhǔn)如下：研究組中快速進(jìn)展性AIED患者為單側(cè)/雙側(cè)聽力下降，PTA>30 dB HL，病程在4周至4月；梅尼埃病患者則根據(jù)美國耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)會(huì)(AAO-HNS)診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]作出診斷，PTA>30 dB HL，病程1～3年；遺傳性聾患者具有耳聾家族史和/或基因突變檢查陽性，剔除有明確藥物性或創(chuàng)傷性致聾者；對(duì)照組為確診的其他自身免疫性疾病患者，包括格林巴利綜合征、皮肌炎等，剔除聽力損傷者。

1.2研究方法 所有研究組對(duì)象取血時(shí)均處于聽力下降發(fā)作或持續(xù)期，對(duì)照組患者處于疾病發(fā)作期，在接受治療前取周圍靜脈血2 ml，離心后取血清，存放于-20℃冰箱內(nèi)保存，在8周內(nèi)完成檢測。

采用酶聯(lián)免疫標(biāo)記法(ELISA)分別定量檢測患者P0蛋白抗體IgG和IgM濃度。試劑盒分別為人P0蛋白抗體IgG、IgM酶聯(lián)免疫分析試劑盒(美國RB 公司，上海玉博生物科技有限公司代理)。應(yīng)用雙抗原夾心法檢測標(biāo)本中人P0 蛋白抗體IgG和IgM水平。用純化的人P0 蛋白抗體IgG和IgM抗原包被微孔板，制成固相抗原，分別往包被抗原的微孔中依次加入P0 蛋白抗體IgG和IgM，再分別與HRP 標(biāo)記的P0 蛋白抗體IgG和IgM抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的P0 蛋白抗體IgG和IgM呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀(BioTek，RPPWL/96)在450 nm波長下測定吸光度(OD 值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人P0 蛋白抗體IgG和IgM濃度。IgG檢測范圍：2～80 ng/L ，IgM檢測范圍：1～70 ng/L。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行Mann-Whiney U檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1研究組和對(duì)照組周圍血清MPZ抗體表達(dá)濃度 研究組周圍血清MPZ抗體IgG和IgM明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。比較不同類型AIED的IgG濃度，可見其濃度由高至低依次為快速進(jìn)展性AIED、梅尼埃病、遺傳性聾，三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，IgM濃度亦呈現(xiàn)相同趨勢。而對(duì)照組IgG和IgM濃度接近遺傳性聾者，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 各組周圍血清P0蛋白抗體IgG、IgM濃度比較(ng/L)

2.2雙側(cè)梅尼埃病患者周圍血清P0蛋白抗體IgG、IgM濃度 梅尼埃病患者IgG濃度與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 但I(xiàn)gM濃度卻明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。其中4例雙側(cè)梅尼埃病患者的IgG濃度為57.00±8.04 ng/L(范圍：47.23～66.92ng/L)，IgM濃度為50.86±1.99 ng/L(范圍：48.57～53.36 ng/L)，不僅明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，也高于單側(cè)梅尼埃病患者[IgG濃度32.14±11.38 ng/L(范圍：19.10～45.35 ng/L)，IgM濃度31.47±15.56 ng/L(范圍：13.57～53.36 ng/L)](P<0.05)。雙側(cè)梅尼埃病患者周圍血清IgG和IgM濃度接近快速進(jìn)展性AIED患者，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3快速進(jìn)展性AIED和雙側(cè)梅尼埃病周圍血清P0蛋白抗體IgG和IgM濃度比較 快速進(jìn)展性AIED患者周圍血清P0蛋白IgG、IgM濃度≥50 ng/L者均占多數(shù)，<50 ng/L僅少數(shù)。雙側(cè)梅尼埃病患者中P0蛋白IgG濃度≥50 ng/L者和<50 ng/L者各占一半，而IgM濃度≥50 ng/L者占75%，<50 ng/L者僅25%(表2)。與之比較，對(duì)照組中，P0蛋白抗體IgG和IgM濃度大部分<50 ng/L。

表2 快速進(jìn)展性AIED和雙側(cè)梅尼埃病患者周圍血清P0蛋白抗體IgG、IgM濃度(例，%)

3 討論

AIED診斷率極低，主要原因可能是診斷標(biāo)準(zhǔn)不明確，基于經(jīng)驗(yàn)性治療回溯確診；無法對(duì)內(nèi)耳作活檢以取得病理診斷及無確切實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法等，所以，目前報(bào)道其發(fā)病率僅為1/5 000～1/10 000。鑒于近年來對(duì)AIED的深入研究，將部分聽神經(jīng)病、特發(fā)性突聾、梅尼埃病、耳硬化癥、遺傳性聾等病亦納入AIED范疇[2]，故其發(fā)病率應(yīng)遠(yuǎn)高于常見報(bào)道，因此，如何提高診斷效率以便早期治療是值得耳科醫(yī)師注意的問題。

AIED機(jī)制不明，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)揭示T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致感音神經(jīng)性聽力下降[5]。多項(xiàng)研究旨在確定AIED自身抗原，以獲得對(duì)其診斷最有力的證據(jù)[6，7]，包括II型、IX型膠原(HLA-II、IX)、熱休克蛋白-70(HSP70)等，但皆因特異性和敏感性不高，無確切的臨床價(jià)值。

MPZ于1994年由Cao[7，8]提取發(fā)現(xiàn)，為髓鞘蛋白，已知其基因突變與周圍神經(jīng)病關(guān)系密切[9，10]。Starr[11]在以聽神經(jīng)纖維不均勻脫髓鞘為特征的聽神經(jīng)病患者外周血清中發(fā)現(xiàn)抗MPZ抗體，并證實(shí)兩者有關(guān)聯(lián)。

本研究發(fā)現(xiàn)AIED患者周圍血清MPZ抗體IgG和IgM濃度比對(duì)照組明顯增高(P<0.01)，在不同類型AIED比較中，快速進(jìn)展性AIED患者M(jìn)PZ IgG和IgM、梅尼埃病患者M(jìn)PZ IgM有診斷意義，而后者的MPZ IgG以及遺傳性聾患者M(jìn)PZ IgG和IgM卻無診斷意義，提示MPZ對(duì)于AIED的診斷有一定特異性，但可能存在不同MPZ亞型，尚待深入研究。

值得注意的是，周圍血清MPZ抗體檢測并非僅對(duì)快速進(jìn)展性AIED有診斷價(jià)值。本研究中梅尼埃病患者雖僅IgM濃度升高，與文獻(xiàn)報(bào)道梅尼埃病患者P0蛋白抗體檢出率5.4%～45.8%[8,12，13]相符，表明MPZ抗體對(duì)于梅尼埃病的診斷有一定敏感性。但進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)雙側(cè)梅尼埃病患者血清MPZ抗體IgG和IgM濃度均遠(yuǎn)高于對(duì)照組，診斷價(jià)值接近于快速進(jìn)展性AIED，可見，周圍血清MPZ抗體檢測診斷雙側(cè)梅尼埃病的價(jià)值明顯高于單側(cè)，也間接提示周圍血清MPZ存在不同亞型的可能。

正常人血清中IgG占70%～75%，IgM僅占6%，故IgM升高較IgG更有診斷意義。從本研究結(jié)果看，無論是快速進(jìn)展性AIED還是雙側(cè)梅尼埃病患者，其周圍血清MPZ IgM濃度對(duì)診斷的敏感性好，大于50 ng/L者占75%以上，而IgG濃度卻未達(dá)到類似結(jié)果。提示對(duì)于快速進(jìn)展性AIED和梅尼埃病患者，檢測周圍血清MPZ抗體IgM濃度更具臨床診斷意義。

總之，周圍血清MPZ抗體表達(dá)，特別是IgM的表達(dá)，對(duì)于快速進(jìn)展性AIED和雙側(cè)梅尼埃病的診斷，有較高敏感性和特異性，但本研究病例較少，應(yīng)在今后研究中擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究。

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