MMP-9和EGFR在中耳膽脂瘤中的表達(dá)及作用

周宏 周維镕 徐普慶

近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)中耳膽脂瘤引起的骨質(zhì)破壞機(jī)制進(jìn)行了大量研究,并提出許多理論，如: 膽脂瘤的機(jī)械壓力作用、慢性感染引起骨髓炎、pH值改變、破骨細(xì)胞的骨溶解作用、酶類介導(dǎo)的骨吸收作用、細(xì)胞因子參與的骨質(zhì)破壞作用等[1]，盡管中耳膽脂瘤骨質(zhì)破壞的確切病因尚未清楚,但關(guān)于中耳膽脂瘤骨質(zhì)破壞吸收的機(jī)制主要有兩種學(xué)說[2], 即“機(jī)械壓迫學(xué)說”和“生物化學(xué)學(xué)說”。前者認(rèn)為中耳膽脂瘤骨吸收主要是由于中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞的過度增殖和凋亡引發(fā)角化上皮脫落加速，使膽脂瘤不斷增大，通過對(duì)周圍骨質(zhì)的機(jī)械壓迫而使骨質(zhì)吸收和破壞；研究發(fā)現(xiàn)[3]中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)蛋白的高比例存在，且不同膽脂瘤上皮以及同一膽脂瘤上皮的不同區(qū)域具有表達(dá)的不均一性，提示EGFR與不同的增殖活性有關(guān)。而后者指出在中耳膽脂瘤組織中存在大量酶, 它們對(duì)骨質(zhì)的破壞起著重要作用；有實(shí)驗(yàn)[4]表明基質(zhì)金屬蛋白酶-9(human middle ear cholesteatoma，MMP-9)與中耳膽脂瘤的骨質(zhì)破壞作用關(guān)系密切,是中耳膽脂瘤致骨質(zhì)破壞的重要物質(zhì)。因此，本研究擬通過檢測(cè)MMP-9、EGFR在中耳膽脂瘤中的分布及表達(dá)水平, 觀察二者與骨質(zhì)破壞程度的相互關(guān)系, 進(jìn)一步探討中耳膽脂瘤骨質(zhì)破壞的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 中耳膽脂瘤組織和耳道深部正常皮膚均取自2008～2009年南通大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科收治的中耳膽脂瘤患者的手術(shù)標(biāo)本, 共22例，年齡5～65歲, 男女之比為13∶9。每例均取一塊典型的中耳膽脂瘤上皮組織，并取一塊外耳道深部正常皮膚作對(duì)照。中耳肉芽組織取自2008～2009年南通大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科收治的伴肉芽增生的慢性化膿性中耳炎患者的手術(shù)標(biāo)本，共10例, 年齡13～67歲,男女之比為3∶7。標(biāo)本于手術(shù)中取出后經(jīng)有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生檢查證實(shí)診斷無誤。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本染色 采用LAB VISION 2D全自動(dòng)免疫組化染色儀，ELIVISON二步法進(jìn)行染色。標(biāo)本經(jīng)4%福爾馬林固定、LEICA自動(dòng)脫水、透明、浸蠟處理，包埋成蠟塊，切片厚度4～5 μm，將載玻片排列整齊烘干, 經(jīng)POLY-L防脫片處理。置于溫度67 ℃烘箱中烘片2小時(shí)，脫蠟至水，PBS沖洗，分別按照MMP-9和EGFR一抗的要求進(jìn)行預(yù)處理。處理完畢后放入自動(dòng)免疫組化染色儀中，編程，從自動(dòng)免疫組化染色儀中取出已染色完畢的切片，蘇木素復(fù)染，0.1%HCl分化, 自來水沖洗, 藍(lán)化, 切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥, 二甲苯透明,中性樹膠封固。

1.2.2結(jié)果判定

1.2.2.1MMP-9和EGFR的分布及表達(dá)水平判定 中耳膽脂瘤上皮組織和中耳肉芽組織、耳道深部正常皮膚的細(xì)胞膜或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，根據(jù)染色強(qiáng)度分為弱陽性(淡黃色)、中等陽性(棕色)、強(qiáng)陽性(棕褐色)。采用多媒體彩色免疫組化病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行定量分析。每張切片于200倍視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)4個(gè)視野，計(jì)算陽性表達(dá)率及平均光密度(A值)，取其均值為該標(biāo)本測(cè)量結(jié)果。

1.2.2.2中耳膽脂瘤侵襲能力評(píng)定[5]術(shù)中觀察中耳膽脂瘤病變范圍及聽小骨破壞情況, 無明顯聽小骨破壞者記為(+), 破壞砧骨者記為(++), 破壞砧骨和錘骨者記為(+++ ), 破壞砧骨、錘骨、乳突天蓋和/或乙狀竇骨板者記為(++++)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件Stata 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析,其中MMP-9或EGFR的各組標(biāo)本之間及兩者之間差異性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，兩者之間相關(guān)性分析采用Pearson Correlation法,顯著性水準(zhǔn)α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1MMP-9和EGFR陽性細(xì)胞的表達(dá) 18例中耳膽脂瘤上皮、4例中耳肉芽組織和10例外耳道上皮組織中，MMP-9和EGFR呈陽性染色，在中耳膽脂瘤上皮染色最強(qiáng), 多為中等至強(qiáng)陽性表達(dá), 上皮組織各層細(xì)胞均有表達(dá), 基底膜染色較強(qiáng), 兩者的表達(dá)分布相同, 但從表達(dá)程度上看, MMP-9的表達(dá)稍強(qiáng)于EGFR(圖1～3)。在中耳肉芽組織及外耳道皮膚中MMP-9和EGFR均有不同程度的表達(dá), 染色多為弱陽性。統(tǒng)計(jì)分析顯示各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中耳膽脂瘤組織中MMP-9和EGFR的陽性表達(dá)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

2.2MMP-9和EGFR在中耳膽脂瘤中的表達(dá)與骨質(zhì)破壞的關(guān)系 本組中耳膽脂瘤侵襲能力評(píng)定(+)1例,(++)4例,(+++)10例，(++++)7例。 MMP-9和EGFR在(+-++)、(+++)、(++++)各級(jí)中耳膽脂瘤的平均A值(M)分別為0.24、0.26、0. 30和0.22、0.24、0.27,各級(jí)的平均A值之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05), 進(jìn)一步作兩兩比較發(fā)現(xiàn)不同級(jí)別之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(兩兩組間比較均為P<0.05)。

表1 中耳膽脂瘤組織、肉芽組織、外耳道深部正常皮膚中MMP-9和EGFR的陽性表達(dá)

注：*與同一標(biāo)本中MMP-9的表達(dá)相比較，P<0.05

圖1 中耳膽脂瘤上皮MMP-9陽性表達(dá)(免疫組化染色×200) 全層細(xì)胞強(qiáng)陽性圖2 中耳膽脂瘤上皮EGFR陽性表達(dá)(免疫組化染色×200) 全層細(xì)胞強(qiáng)陽性圖3 中耳膽脂瘤上皮MMP-9、EGFR陽性表達(dá)(免疫組化染色×200) 全層細(xì)胞強(qiáng)陰性

2.3MMP-9和EGFR表達(dá)的相互關(guān)系 MMP-9和EGFR在中耳膽脂瘤中表達(dá)均為陽性15例,均為陰性3例, MMP-9和EGFR之間有相關(guān)性(r=0.488,P<0.05); 經(jīng)Pearson相關(guān)分析顯示, 15例MMP-9、EGFR表達(dá)均陽性的中耳膽脂瘤中, 二者的平均A值之間存在相關(guān)性(P<0.05) 。

3 討論

中耳膽脂瘤形成的確切機(jī)制目前尚不清楚, 其危害主要決定于其對(duì)周圍骨質(zhì)的破壞程度, 因此了解其骨質(zhì)破壞的發(fā)生機(jī)制對(duì)于阻斷疾病的發(fā)展及減少并發(fā)癥的發(fā)生、防止復(fù)發(fā)是至關(guān)重要的。MMP-9是MMPs分子量最大的酶，是引起基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)降解的重要成分，它以酶原形式分泌, 被激活后形成Ⅳ型膠原酶, 直接參與生理和病理性溶骨過程[6]。研究表明, 表皮生長(zhǎng)因子(EGF)能促進(jìn)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞增生, 增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的趨化和吞噬功能。增多的成纖維細(xì)胞在TNF -α等作用下又可合成和分泌多種生物活性酶, 如膠原酶、前列腺素E2等，這些介質(zhì)可引起組織脫鈣、骨質(zhì)和骨蛋白的溶解, 導(dǎo)致骨質(zhì)吸收[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示: MMP-9和EGFR在中耳膽脂瘤中的表達(dá)陽性率及平均A值明顯高于中耳肉芽組織、外耳道深部正常皮膚組織,且二者的表達(dá)與骨質(zhì)的破壞程度相關(guān)，破壞范圍越廣，二者在中耳膽脂瘤中的表達(dá)越明顯。說明MMP-9和EGFR與中耳膽脂瘤的骨質(zhì)破壞作用關(guān)系密切, 它們是中耳膽脂瘤骨質(zhì)破壞中的重要物質(zhì)，與李詠玲[8]的觀點(diǎn)一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，MMP-9在中耳膽脂瘤中的表達(dá)陽性率及平均A值高于EGFR，推測(cè)MMP-9在膽脂瘤的骨質(zhì)破壞作用中可能起了更主要的作用，MMP-9可能直接作用于周圍組織及骨基質(zhì), 起到骨質(zhì)破壞作用。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明兩種蛋白陽性表達(dá)率之間及平均A值之間有相關(guān)性, 后者可能是前者產(chǎn)生的誘導(dǎo)因素,提示MMP-9可在炎癥刺激下,由膽脂瘤上皮組織中的細(xì)胞分泌的EGFR等細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生[2,9]。二者之間的相互作用進(jìn)一步加重骨質(zhì)破壞,共同促進(jìn)中耳膽脂瘤的發(fā)展, 在膽脂瘤的骨質(zhì)破壞中起著關(guān)鍵的作用。

4 參考文獻(xiàn)

1 林刃輿，遲放魯.中耳膽脂瘤形成機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)耳鼻咽喉科學(xué)分冊(cè)，2001，25: 153、212.

2 徐志文, 倪海峰. 膽脂瘤型中耳炎骨質(zhì)破壞機(jī)制及手術(shù)治療[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)耳鼻咽喉科學(xué)分冊(cè), 2005，29: 251.

3 李厚恩, 江平, 汪磊. 膽脂瘤上皮過度增殖行為的免疫組化研究[J]. 中華耳鼻咽喉科雜志, 2002，37:118.

4 葉放蕾,朱麗雅,崔艷紅，等. MMP-9在中耳膽脂瘤中的表達(dá)和意義[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志,2008，16: 412.

5 江超武，展鴻謀,王文惠，等. 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和即刻早期基因及p27在中耳膽脂瘤上皮中的表達(dá)[J]. 中華耳鼻咽喉科雜志，2004,39:211.

6 Fang J, Shing Y, Wiederschain D, et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 97:3 884.

7 孫文忠,徐志文,唐安洲，等.膽脂瘤上皮細(xì)胞增殖與凋亡的信息傳導(dǎo)及基因調(diào)控[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)耳鼻咽喉科學(xué)分冊(cè), 2005,29:131.

8 李詠玲.膽脂瘤型中耳炎的骨質(zhì)破壞機(jī)制研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2008，14:1 054.

9 王輝兵，徐志文，唐安洲.膽脂瘤型中耳炎骨質(zhì)破壞機(jī)制的組織酶學(xué)研究[J].耳鼻咽喉頭頸外科，2002，9：63.