松果腺對大鼠肺臟免疫功能季節(jié)性變化影響的實驗研究＊

袁衛(wèi)玲，馬淑然，郭霞珍，顧曉靜，徐巍華，趙樹宏(.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，天津 30093;.北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京 0009)

根據(jù)中醫(yī)天人相應理論，自然界的季節(jié)變化對人體的生理病理具有重要的影響作用?，F(xiàn)代生物學研究也表明，人體內存在一種受到光照調節(jié)并具有高位調控作用的組織-松果腺，它分泌的褪黑素(Melatonin，簡稱Mel)通過視覺和皮膚兩條生物信號轉導通路使其分泌與太陽光的運動同步，具有晝夜和季節(jié)性節(jié)律。Mel具有重要的免疫調節(jié)功能，不僅影響免疫器官的生長發(fā)育，而且對體液和細胞免疫均起到調節(jié)作用。研究表明，Mel與肺臟免疫密切相關[1]，它與肺組織上分布的褪黑素受體(Melatonin receptor，簡稱MR)結合，由G蛋白介導，通過級聯(lián)放大效應對第一、第二等信號物質發(fā)揮作用，對肺部免疫直接產(chǎn)生影響。此外，Mel的自由基清道夫和抗氧化劑活性作用，能降低其調控的誘導型一氧化氮合成酶活性及支氣管肺泡灌洗液中一氧化氮含量，減輕哮喘大鼠氣道炎癥和氣道高反應性[2]。由于松果腺-褪黑素既具有季節(jié)性節(jié)律，又能對肺臟免疫產(chǎn)生直接或間接調節(jié)作用。因此，本實驗采用松果腺摘除動物模型，通過觀測大鼠肺泡灌洗液中(BALF)中免疫相關物質的變化，來探討松果腺對大鼠肺臟免疫功能季節(jié)性變化影響的作用機制。

1 材料

1.1 動物

健康Wistar大鼠 SPF級，雄性96只，體重160g±10g，分別于春分、秋分、夏至、冬至前40d由北京維通利華實驗動物技術有限公司購入，實驗動物許可證號SCXK(京)2007-0002。飼養(yǎng)條件:自然光照(不加人工照明)，室溫、濕度自然，自由攝取水及飼料。

1.2 主要儀器和試劑

低溫高速離心機(美國 BECKMAN公司產(chǎn))，PW2003型培養(yǎng)箱(重慶四達實驗儀器廠)，307-2B型牙科臺式電鉆機(上海醫(yī)療器械廠)，BIO RAD 550酶標儀(美國博樂公司產(chǎn))，OLYMPUS BX5顯微鏡(日本OLYMPUS珠式公社)，Hanks液(購自北京化學試劑公司)，小牛血清白蛋白(購自北京駿騰生物技術有限公司)，雞靜脈血(購自北京實驗動物研究中心)，IL-2、IFN-γ和 sIgA(RD進口分裝，均購自北京博惠嘉業(yè)生物技術有限公司)。

2 方法

2.1 分組

隨機分為生理組、手術組(松果腺摘除模型組)和偽手術組，每組各8只。手術組、偽手術組分別于春分、秋分、夏至、冬至(以下簡稱二分、二至)前1個月施行手術造模，與生理組動物在相同條件下飼養(yǎng)到二分、二至當日20∶00以后處死取材。

2.2 動物造模與檢測方法

2.2.1松果腺摘除動物模型 10%水合氯醛3～4ml/kg腹腔注射麻醉、固定、消毒，頭頂皮膚切口約2cm，暴露顱骨矢狀縫和人字縫。在人字縫和矢狀縫兩側用牙科鉆切割矩形骨片，暴露矢狀靜脈(SSV)和橫向靜脈竇(TS)，沿SSV兩側縱向切開硬腦膜，雙側結扎SSV，剪斷并向后翻轉斷端靠近竇匯(CS)端，用眼科鑷摘取出松果腺，把SSV放回原位，放置少許明膠海綿止血、清創(chuàng)，點適量青霉素干粉預防感染，縫合皮膚并消毒，創(chuàng)口再點適量青霉素干粉。術后注射青霉素注射液3d。

2.2.2 偽手術動物模型 操作過程同上，只是向后翻轉SSV斷端后，不摘除松果腺，也不將鑷子尖端伸入竇匯下，以避免對松果腺及其神經(jīng)纖維的損傷。

2.2.3 肺泡灌洗液的獲取 分別于二分、二至當日20∶00時，將大鼠麻醉固定，隨即開胸暴露氣管。用棉線結扎離心端，在其下方2個軟骨環(huán)間做一切口并插入導管，導管與5ml注射器連接，從支氣管分叉處用棉線結扎右側支氣管，用4℃生理鹽水4ml進行左肺灌洗，注射器抽吸6遍，回收液約為2ml～2.5ml，將回收液低溫4℃ 2000r/min，離心15min將上清液收集、分裝，－70℃低溫冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 肺泡灌洗液中巨噬細胞(AM)吞噬功能的測定 雞紅細胞吞噬法[3]。

2.2.5 肺泡灌洗液中 IL-2，IFN-γ和 sIgA的測定 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA法)。

2.3 統(tǒng)計學方法

各組數(shù)據(jù)均用均數(shù) ±標準差表示，運用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析。各季節(jié)組內及4季節(jié)每組間比較均采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

3 結果

3.1 松果腺對大鼠 BALF中 IL-2和 IFN-γ四季含量變化影響的比較

表1顯示，與同一季節(jié)比較，春分時 IL-2和IFN-γ手術組含量顯著低于生理組(P<0.05)。全年IL-2和IFN-γ偽手術組與生理組相比，無顯著差異(P>0.05)。

與不同季節(jié)比較，生理組:IL-2春分、夏至高于秋分，差異十分顯著(P<0.01);春分高于冬至，差異十分顯著(P<0.01);夏至顯著高于冬至(P<0.05)。IFN-γ春分、夏至顯著高于秋分和冬至(P<0.05)。手術組:IL-2夏至顯著高于秋分(P<0.05)，IFN-γ夏至顯著高于春分、秋分和冬至(P<0.05，P<0.01)。

表1 松果腺對大鼠BALF中IL-2和IFN-γ含量四季變化影響的比較

表1 松果腺對大鼠BALF中IL-2和IFN-γ含量四季變化影響的比較

注:與同一季節(jié)生理組比較:*P<0.05;與同組春分比較:★P<0.05;與同組秋分比較:#P<0.05，##P<0.01;與同組冬至比較:△P<0.05，△△P<0.01

季節(jié)n IL-2 IFN-γ生理組 手術組 偽手術組 生理組 手術組 偽手術組春分 8 102.937±20.764##△△ 74.217±23.774*94.443±22.373 131.452±27.235#△ 102.489±15.288*125.910±29.270夏至 8 92.848±14.515##△ 85.775±14.752#75.116±25.849 128.723±28.390#△ 126.921±24.056★#△△123.472±25.715秋分 8 63.794± 6.509 66.582± 8.099 74.937±20.150 95.516±15.931 100.370±18.316 112.207±14.185冬至 8 73.137±17.856 69.445± 9.502 77.848±10.71096.029±30.015 90.748±18.201 99.246±23.476

3.2 松果腺對大鼠BALF中sIgA含量和AM吞噬率四季變化影響的比較

表2顯示，與同一季節(jié)比較，春分時，sIgA手術組顯著低于生理組和偽手術組(P<0.05);秋分時，手術組、生理組顯著低于偽手術組(P<0.05，P<0.01);除秋分外，其余3季生理組與偽手術組相比，無顯著差異(P>0.05)。夏至時，AM吞噬率手術組顯著低于生理組(P<0.05);冬至時，手術組顯著低于偽手術組(P<0.05);全年AM吞噬率偽手術組與生理組相比，無顯著差異(P>0.05)。

與不同季節(jié)比較，生理組:sIgA秋分低于春分和夏至，差異極顯著(P<0.01);冬至顯著低于春分和夏至(P<0.05)。偽手術組:sIgA冬至顯著低于春分(P<0.05)。手術組:sIgA春分顯著低于夏至(P<0.05);秋分、冬至低于夏至，差異極顯著(P<0.01)。

表2 松果腺對大鼠BALF中sIgA含量和AM吞噬率四季變化影響的比較

表2 松果腺對大鼠BALF中sIgA含量和AM吞噬率四季變化影響的比較

注:與同一季節(jié)生理組比較:*P<0.05，＊＊P<0.01;與同一季節(jié)偽手術組比較:#P<0.05;與同組春分比較:☆P<0.05;與同組夏至比較:★P<0.05，★★P<0.01;與同組秋分比較:△△P<0.01;與同組冬至比較:▲P<0.05

季節(jié)n sIgA(pg/ml)AM吞噬率(%)生理組 手術組 偽手術組 生理組 手術組 偽手術組春分 8 5.619±1.000△△▲ 3.925±0.775*#★ 5.405±1.530 39.480±13.532 37.276±13.536 36.436±15.084夏至 8 5.494±1.362△△▲ 5.183±0.850 5.061±1.498 45.306±10.821 32.885± 5.656* 36.430±12.797秋分 8 2.974±1.072 3.311±0.499#★★ 4.795±1.211＊＊ 37.795±11.837 34.892±10.265 44.597±11.735冬至 8 3.817±1.114 3.615±1.126★★ 3.893±1.0641☆ 38.480±11.891 33.566± 7.571#48.108± 8.466

4 討論

4.1 松果腺對大鼠肺臟免疫調節(jié)以增強為主

考慮到松果腺摘除手術操作過程可能會對實驗結果造成影響，如應激反應，故專門設立偽手術組以作對照。由于松果腺分泌的Mel不僅具有季節(jié)節(jié)律，還有晝夜節(jié)律，血液Mel含量白天低而夜間高，且最高含量值出現(xiàn)在凌晨2∶00～3∶00，為了使手術組和偽手術組更明顯、更準確地與生理組比較，故在二分、二至當日20∶00后取材。

在細胞免疫中，細胞因子白細胞介素-2(IL-2)主要由活化的Th1細胞產(chǎn)生，它的生物活性是刺激多種細胞的生長和分化，包括T淋巴細胞和自然殺傷性細胞(NK細胞)的增殖，促進活化的B細胞分化、增生和分泌免疫球蛋白，同時也通過作用于單核細胞，促進其分泌 IL-1。有研究顯示[4、5]，在慢性支氣管炎動物模型中肺組織和外周血中IL-2含量明顯降低。另一重要的細胞因子 γ-干擾素(IFN-γ)具有干擾病毒感染和復制的能力，它主要能活化T細胞和NK細胞產(chǎn)生，可直接促進T、B細胞分化和細胞毒性T細胞(CTL)成熟，刺激B細胞分泌抗體，具有強大的免疫調節(jié)作用。由于呼吸道感染的病原中病毒占重要地位，故IFN-γ的特異性防御機制極為重要。在體液免疫中分泌型IgA(sIgA)是呼吸道黏膜的主要保護性抗體，也是機體抗感染的一道重要的“屏障”，能阻止細菌附著在黏膜的表面溶解細菌，并可中和病毒和毒素。在肺臟的非特性免疫功能中肺泡巨噬細胞(AM)較強的吞噬殺傷能力，可非特異性吞噬殺傷多種病原微生物，在人體防御各種各樣的致病因素入侵的過程中發(fā)揮極其重要的作用。AM主要分布于呼吸道、肺泡表面，約占BALF細胞總數(shù)的90%以上。肺臟具有不斷暴露于外界異物侵入的特殊性，AM吞噬功能的強弱則與肺部感染密切相關。由于 IL-2、IFN-γ、sIgA和 AM與肺臟免疫關系密切，故本實驗選取IL-2和IFN-γ反映肺臟的細胞免疫功能，sIgA反映體液免疫功能，AM吞噬率代表非特異性免疫功能。

本研究結果顯示，正常生理情況下，全年大鼠BALF中 IL-2、IFN-γ、sIgA含量和 AM 吞噬率均呈現(xiàn)春夏高于秋冬的變化趨勢，而偽手術組 IFN-γ和sIgA含量也呈現(xiàn)春夏高于秋冬的變化特點，與生理組變化一致。另外除sIgA秋分外，其余指標生理組與偽手術組四季比較無顯著性差異，說明本實驗手術操作過程基本不影響B(tài)ALF中相關免疫物質含量的變化。

摘除松果腺后，BALF中AM吞噬率四季數(shù)值雖均較生理組有下降的變化特點，其中夏至手術組比生理組顯著降低。IL-2、IFN-γ和sIgA含量，除秋分時數(shù)值略升高外，其余3個季節(jié)數(shù)值均較生理組有下降的趨勢。其中春分、冬至時，手術組IL-2、IFN-γ和sIgA含量低于生理組和偽手術組，以IL-2和IFN-γ含量顯著低于生理組(P<0.05)，sIgA含量顯著低于生理組和偽手術組(P<0.05)。雖然這3個指標在秋分時摘除松果腺手術組較生理組數(shù)值升高，但手術組與生理組、偽手術組之間無顯著性差異，僅僅有略升高的變化趨勢而已。這種升高可能是季節(jié)性因素造成的，亦可能是大鼠對手術創(chuàng)傷的應激性反應?？梢姡晒賹ALF中免疫相關物質調節(jié)以增強作用為主。

4.2 松果腺對大鼠肺臟免疫調節(jié)具有季節(jié)選擇性

摘除松果腺手術后，BALF中 IL-2、IFN-γ和sIgA含量除秋分時數(shù)值略升高外，其余3個季節(jié)數(shù)值均較生理組有下降的特點，以春分時顯著(P<0.05)，說明松果腺在春分時對 IL-2、IFN-γ和 sIgA的免疫上調作用顯著。而AM吞噬率四季手術組數(shù)值均較生理組有下降的特點，以夏至時顯著(P<0.05)，說明松果腺在夏至時對AM有顯著的免疫上調作用?？梢?，松果腺在不同的季節(jié)對免疫物質的調節(jié)作用不完全一致，它對大鼠肺臟免疫調節(jié)功能可能具有季節(jié)選擇性，這也與我們前期研究結論相吻合[6]。但松果腺對不同免疫物質季節(jié)選擇性的具體調節(jié)免疫機制仍有待于進一步深入研究。

4.3 松果腺對大鼠肺臟免疫功能季節(jié)性變化的影響具有復雜性

全年生理組大鼠 BALF中 IL-2、IFN-γ、sIgA含量和AM吞噬率存在春夏高于秋冬的季節(jié)節(jié)律性，但松果腺摘除后除 AM吞噬率外，IL-2、IFN-γ和sIgA含量仍表現(xiàn)為春夏高于秋冬的變化特點，只是生理組以春分含量最高為顯著，而手術組以夏至含量最高為顯著，但生理組與手術組的整體變化趨勢提示松果腺對大鼠肺臟免疫功能季節(jié)性變化的影響不具有惟一性。分析其原因可能為，松果腺雖然主要分泌褪黑素，但不是內源性褪黑素的惟一來源。研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜、卵巢、腎上腺、睪丸、周圍神經(jīng)、交感神經(jīng)、腦垂體和甲狀腺等組織中亦有表達。將實驗大鼠松果腺摘除后，血內仍可測得褪黑素，說明尚有次級分泌來源[7]。而本實驗摘除松果腺后大鼠肺臟免疫功能仍部分存在著春夏高于秋冬的季節(jié)節(jié)律性，表明除松果腺外，可能有其他內源性褪黑素的分泌影響著肺臟的免疫功能。

由本實驗可發(fā)現(xiàn)，松果腺作為“授時因子”，能感受光照刺激，高位調節(jié)人體免疫功能，但對肺臟局部免疫調節(jié)并非在每個季節(jié)對每個指標都有影響，且在不同的季節(jié)調節(jié)作用不一致，不能單一地概括為上調或下降，因此松果腺對肺臟免疫功能季節(jié)性變化調節(jié)不具有惟一性而較復雜。但總體上來看，松果腺對機體肺臟局部免疫以上調作用為主。除光照外，溫度、濕度等其他外界因素也影響著松果腺分泌Mel的生理效應，進而影響肺臟免疫功能。肺臟免疫功能季節(jié)性變化節(jié)律的形成受影響的因素非常多，Mel作為神經(jīng)內分泌激素之一，與肺臟免疫有十分密切的聯(lián)系，兩者之間的節(jié)律性變化是否有某種內在緊密聯(lián)系，其間相關性和作用機制值得進一步深入探討。

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