葉酸偶聯(lián)華蟾素殼聚糖納米粒的制備及其特性研究＊

李宏良 田華琴 梁貴文 黃小青 陳學(xué)彰 王 斌 楊耀林

廣東省佛山市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤血液科(佛山 528000）

葉酸偶聯(lián)華蟾素殼聚糖納米粒的制備及其特性研究＊

李宏良 田華琴△梁貴文 黃小青 陳學(xué)彰 王 斌 楊耀林

廣東省佛山市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤血液科(佛山 528000）

目的:制備葉酸偶聯(lián)殼聚糖載華蟾素納米粒,并檢測(cè)其體外性質(zhì)。方法:首先合成葉酸偶聯(lián)殼聚糖,再制備負(fù)載華蟾素的葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒,并測(cè)定葉酸偶聯(lián)華蟾素殼聚糖納米粒的載藥量、包封率及累積釋藥量。結(jié)果:制備了葉酸偶聯(lián)華蟾素殼聚糖納米粒,載藥量為9.7%,包封率為61.3%,12h累積釋藥量為42.6%,72h累積釋藥量為63.3%。結(jié)論:葉酸偶聯(lián)華蟾素殼聚糖納米粒制備工藝簡(jiǎn)單,性能較好。

華蟾素(Cinobufacini）注射劑是傳統(tǒng)中藥中華大蟾蜍皮的水制劑,其成分為吲哚生物堿,具有抑制腫瘤生長(zhǎng)和刺激免疫系統(tǒng)的雙重作用,臨床廣泛用于腫瘤的治療。但華蟾素存在導(dǎo)致嚴(yán)重的靜脈炎等不良反應(yīng)[1],限制了藥物的劑量。為了減輕其不良反應(yīng),并提高其抗腫瘤的療效,本文選擇具有減輕化療藥物毒性的殼聚糖(chitosan,CTS）為載體,偶聯(lián)具有腫瘤靶向的藥物——葉酸(FA）,制備負(fù)載華蟾素的葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒,同時(shí)對(duì)其體外性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。

1材料與儀器1.1 材料 殼聚糖(CTS,濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司,脫乙酰度＞90%）,多聚磷酸鈉(TPP,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）,葉酸(FA,Sigma公司）,華蟾素(安徽金蟾生化股份有限公司,081005-1）,5-羥色胺對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):111656-200401）,1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺(EDC,Sigma公司）,無(wú)水二甲基亞砜(DMSO,國(guó)產(chǎn)分析純）。

1.2 儀器 78-1磁力加熱攪拌器(中國(guó)江蘇）,冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Lab）,H-600透射電鏡(HITACHI）,ZetaSizer3000HS激光粒度分析儀(英國(guó)Malvem 公司）,UV-265FW 型紫外分光光度計(jì)(日本島津）、AVantiTM30低溫超速離心機(jī)(美國(guó)）、熒光顯微鏡(美國(guó)Model550）,酶標(biāo)儀(德國(guó)Leica）。

2方法和結(jié)果2.1 葉酸偶聯(lián)殼聚糖的制備及純化 參照文獻(xiàn)[2],稱取葉酸(FA）300mg、EDC260mg,溶于15mL無(wú)水DMSO中,室溫避光磁力攪拌1h至FA全部溶解。加入5mg/mLCTS醋酸水溶液(pH4.7）30mL,室溫避光磁力攪拌過(guò)夜。用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至9.0。用PBS液透析3d,再用雙蒸水透析3d。冷凍干燥得淡黃色粉末。

2.2葉酸偶聯(lián)華蟾素殼聚糖納米粒制備 取6mg葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒溶于5mL1%醋酸溶液中,用NaOH調(diào)節(jié)pH至5.0,磁力攪拌,并逐滴滴加適量的華蟾素,然后往攪拌的溶液中滴加2mL0.6mg/mLTPP溶液,磁力攪拌30min。將所得溶液雙蒸水透析24h,冰浴超聲分散30min,過(guò)0.45um濾膜,即得載藥納米粒。

2.3 葉酸偶聯(lián)華蟾素殼聚糖納米粒的形態(tài)學(xué)特征及粒徑測(cè)量 取納米粒液適量,滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上,靜置1min,用2%磷鎢酸負(fù)染6min,在透射電鏡下觀察形態(tài)和大小。另取納米粒溶液用激光衍射粒度分析儀測(cè)定平均粒徑及粒徑分布。結(jié)果顯示透射電鏡觀察可見(jiàn)球形納米微粒,粒子形狀規(guī)則,大小均勻,無(wú)粘連。實(shí)驗(yàn)測(cè)得葉酸偶聯(lián)華蟾素殼聚糖納米粒的平均粒徑為213.7nm。

2.4 載藥量、包封率和累計(jì)釋放度的測(cè)定 2.4.1華蟾素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密稱取5-羥色胺對(duì)照品10mg,置50mL量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。精密量取對(duì)照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,分別置10mL量瓶中,加水使成5mL,搖勻,加15%對(duì)二甲氨基苯甲醛濃鹽酸溶液(2→3）至刻度,搖勻,室溫放置30min,照分光光度法(《中國(guó)藥典》2005版第一部附錄28）,以水為空白,在555nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度(A）,以A為縱坐標(biāo),濃度(C）為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為:A=0.0074C-0.0896(r=0.9997）,表明 5-羥色胺在 22.3～ 115.2μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 葉酸偶聯(lián)華蟾素殼聚糖納米粒包封率及栽藥量的測(cè)定:將制備的載藥納米粒動(dòng)態(tài)透析72h,期間換透析介質(zhì)水3次,除去黏附未包裹的華蟾素,透析后冷凍干燥。精密稱取純化后葉酸偶聯(lián)殼聚糖載藥納米球約50mg,置于100mL燒瓶中,加0.1mol/L鹽酸溶液50mL,60℃水浴回流3h使納米球完全溶解,放冷,定容,過(guò)濾,取濾液1mL稀釋至10mL,于555nm處測(cè)定吸光度。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離華蟾素的量,并計(jì)算包封率和載藥量。結(jié)果測(cè)得包封率為61.3%,載藥量為9.7%。

2.4.3 葉酸偶聯(lián)華蟾素殼聚糖納米粒體外釋藥的考察:精密稱取凍干后的載藥納米粒5.0mg,溶于1mL磷酸緩沖液(PBS,pH7.4）,取50μL置于微量透析管,懸浮于25mL離心管內(nèi),于離心管中加入20mL的磷酸緩沖液(PBS,pH7.4）,將其置水浴振蕩器中(溫度37℃,振蕩頻率為100次/min）。分別于第4、8、12、16、20、24、48、72h 取透析袋外 PBS2mL,在555nm處測(cè)定吸光度,同時(shí)補(bǔ)回等量的釋放遞質(zhì)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算其濃度和累積釋放量,取3次實(shí)驗(yàn)的平均值,以累積釋藥百分率對(duì)時(shí)間作圖,繪制載藥納米粒的釋放曲線。華蟾素在各時(shí)間點(diǎn)的累積釋放百分率(Q）計(jì)算公式為:

式中V0為釋放遞質(zhì)的總體積,V為每次取樣體積,Ct為各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得釋放介質(zhì)中的華蟾素濃度(mg·mL-1）,M 為投入的華蟾素納米粒的質(zhì)量(mg）,X為測(cè)得華蟾素納米粒的載藥量(%）。葉酸偶聯(lián)華蟾素殼聚糖納米粒的釋藥曲線見(jiàn)突釋和緩釋兩個(gè)階段,突釋階段于12h累積釋藥量為42.6%,緩釋階段于72h累積釋藥量為63.3%。見(jiàn)圖1。

圖1 葉酸偶聯(lián)華蟾素殼聚糖納米粒的釋藥曲線

3討 論

殼聚糖(CS）是天然生物大分子甲殼素脫乙?；玫降膲A性多糖,其化學(xué)穩(wěn)定性良好,既有良好的生物相容性及生物可降解性,又有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的效應(yīng),以殼聚糖包封化療藥物可有效降低其毒性,同時(shí)本身也具有一定的抗腫瘤作用[3]。

惡性腫瘤細(xì)胞膜表面葉酸受體(FR）的數(shù)量及活性顯著高于正常細(xì)胞。葉酸具有免疫原性低、易于修飾、易穿透腫瘤、到達(dá)靶點(diǎn)時(shí)間短、血液清除快、穩(wěn)定性高、成本低、易貯存等優(yōu)點(diǎn)。葉酸對(duì)葉酸受體的親和力比單克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞表面的受體的親和力強(qiáng)100倍以上。利用葉酸受體在某些腫瘤部位的過(guò)度表達(dá)而在正常組織低水平表達(dá)的特性可以實(shí)現(xiàn)葉酸偶聯(lián)藥物的腫瘤靶向輸送。因此,葉酸靶向可成為增加化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞敏感性的新途徑[4]。

本文選擇殼聚糖(chitosan,CS）為華蟾素的載體,利用葉酸活性酯與殼聚糖分子上的氨基反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵,制備葉酸偶聯(lián)殼聚糖,利用殼聚糖在偏酸性溶液中帶正電荷,在高速磁力攪拌作用下能與陰離子凝集的特性,制備負(fù)載華蟾素的葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒,測(cè)得載藥量為9.7%,包封率為61.3%,12h累積釋藥量為42.6%,72h累積釋藥量為63.3%。該制備工藝簡(jiǎn)單,性能較好。下一步我們將進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其腫瘤細(xì)胞靶向性及不良反應(yīng)。

[1] 龔愛(ài)平,劉金秀,倪 蓓,等.華蟾素的不良反應(yīng)(附201例臨床觀察）[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1998,18(5）:418-420.

[2] 龔金蘭.汪森明.胡喜鋼,等.腫瘤靶向性藥物載體葉酸殼聚糖微球的制備及特性研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,28(12）:2183-2186.

[3] Hejazi R , Amiji M. Chito san-based gastro in testinal delivery system [J ]. J Control Release, 2003, 89 (2） : 151-165.

[4] Low PS, Antony A C. Folaterecep tor-targeted drugs for cancer and inflamm atory diseases[J ]. Adv Drug Rev, 2004,56: 1055-1058.

華蟾素/生產(chǎn)和制備 工藝,藥學(xué) 納米

R285

A

1000-7369(2011）05-0610-03

＊佛山市科技局醫(yī)學(xué)類(lèi)科技攻關(guān)項(xiàng)目(佛科[2007]29號(hào)）

△通迅作者。

(收稿2010-09-03;修回2010-10-09）