鐵皮石斛莖段組培快繁體系的改良研究

張紅兵，武 蕓，2，劉金龍，蒲 鑫，張朝舉，吳 娟，鄭小江，*

(1.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北民族學(xué)院)，湖北 恩施 445000)

鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)為蘭科石斛屬多年附生草本植物，是名貴中藥西楓斗的原植物[1].有“除脾下氣，補(bǔ)五臟虛勞羸弱，強(qiáng)陰，久服厚腸胃，輕身延年”[2]的效果.近年來(lái)，許多學(xué)者對(duì)鐵皮石斛的有效成分及作用進(jìn)行了研究，其含有多糖、氨基酸及多種無(wú)機(jī)元素，具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖的作用[3].

目前，鐵皮石斛的組織培養(yǎng)已是一項(xiàng)日漸成熟的繁殖技術(shù).但組織培養(yǎng)過(guò)程中還存在褐化、分化率低等限制增殖的問(wèn)題.雷文瑾[4]研究發(fā)現(xiàn)在組織培養(yǎng)基中加入活性炭能夠很好的防止褐化，為解決鐵皮石斛組織培養(yǎng)過(guò)程中的褐化問(wèn)題奠定了基礎(chǔ).筆者在試驗(yàn)中改良了組織培養(yǎng)培養(yǎng)基配方，取得了一定的研究進(jìn)展，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究材料是由湖北仙芝堂生物科技有限公司提供的鐵皮石斛幼嫩莖段.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理 選取帶有芽原基的配皮石斛嫩莖，去掉莖段表面的假鱗.將鐵皮石斛嫩莖切成1～2 cm的莖段，每段帶有一個(gè)莖節(jié).采用以下消毒方式進(jìn)行材料表面消毒[5-6]：自來(lái)水流水沖洗30 min，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精消毒30 s，無(wú)菌水清洗1次；再用0.1%升汞消毒殺菌8 min，最后用無(wú)菌水清洗5次后接種到培養(yǎng)基中.

1.2.2 鐵皮石斛腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的改良 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖20 g·L-1，瓊脂7.6 g·L-1.以NAA(0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1)和6-BA(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg·L-1)不同濃度兩兩組合添加到MS培養(yǎng)基中，優(yōu)選出適合鐵皮石斛腋芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基. 共24個(gè)處理，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種1個(gè)外植體.在溫度(25±2)℃，光照2 000lx、12 h·d-1的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 d后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

1.2.3 鐵皮石斛組織培養(yǎng)過(guò)程中防褐化的研究 以新鮮的鐵皮石斛莖段為外植體，以MS+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7.6 g·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 3.0 mg·L-1為基本培養(yǎng)基，分別添加活性炭(1、2、3、4 g·L-1)或Vc(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g·L-1)進(jìn)行防褐化研究，15 d后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

1.2.4 鐵皮石斛生根培養(yǎng)基的改良 切取通過(guò)腋芽誘導(dǎo)出的鐵皮石斛幼苗，以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1的IBA，接種鐵皮石斛幼苗，培養(yǎng)40 d后觀測(cè)生根的鐵皮石斛幼苗的數(shù)量，探索獲得最適合鐵皮石斛幼苗生根的培養(yǎng)基.

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)結(jié)果

由表1可看出：在相同的NAA濃度下，隨著6-BA濃度的升高，腋芽誘導(dǎo)率增加，在達(dá)到一個(gè)最高值后又逐漸降低；在相同的6-BA濃度下，隨著NAA濃度的升高，誘導(dǎo)率有相同的變化趨勢(shì).處理9、10、17、18均達(dá)到了較高的誘導(dǎo)率，分別為95%、85%、85%、80%，所以最適合鐵皮石斛腋芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7.6 g·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 3.0 mg·L-1.

表1 NAA、6-BA組合對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響

2.2 鐵皮石斛組織培養(yǎng)中防褐化的研究

在培養(yǎng)基中添加活性炭和維生素C均能達(dá)到很好的防褐化效果，在培養(yǎng)過(guò)程中外植體會(huì)分泌出酚類物質(zhì)，被多酚氧化酶系氧化成醌類物質(zhì)，而使培養(yǎng)基褐化，影響外植體的生長(zhǎng)和分化[8-9]，利用活性炭的吸附作用或者維生素C的還原作用可以防止褐化.結(jié)果表明(見表2)2、3、9、10號(hào)處理效果很好，褐化率都為0，即在培養(yǎng)基中加入2～3 g·L-1的活性炭或2.5 g·L-1的Vc均能達(dá)到很好的防褐化的效果.

2.3 鐵皮石斛生根培養(yǎng)基的選擇結(jié)果

在1/2MS為基本培養(yǎng)基的條件下，添加一定濃度的IBA有利于促進(jìn)鐵皮石斛幼苗的生根，研究表明(見表3)，隨著IBA濃度的升高，鐵皮石斛幼苗的生根率增加，當(dāng)IBA的濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，鐵皮石斛幼苗的生根率達(dá)到了90%，IBA濃度繼續(xù)升高，生根率又逐漸降低，獲得誘導(dǎo)鐵皮石斛幼苗生根的最佳培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA 2.0 mg·L-1.

表2 活性炭和維生素C防褐化作用

3 結(jié)論

在總結(jié)前人的研究成果基礎(chǔ)上，根據(jù)鐵皮石斛的生長(zhǎng)特點(diǎn)[7]，研究獲得改良的組織培養(yǎng)最佳的培養(yǎng)基，在腋芽誘導(dǎo)、防治褐化和生根研究三方面均取得了一定的突破.

研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)腋芽的最佳培養(yǎng)基為：MS+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7.6 g·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 3.0 mg·L-1；誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA 2.0 mg·L-1.向培養(yǎng)基中加入活性炭2 g·L-1或Vc 2.5 g·L-1均能有效地防止外植體和培養(yǎng)基的褐化.

[1] 楊一令,來(lái)平凡,蔣士鵬.鐵皮石斛研究進(jìn)展[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,32(1):82-85.

[2] 魏·吳普等述,清·孫星衍等輯.神農(nóng)本草經(jīng)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1982:21.

[3] 劉燦蘭,尚子義,曲衛(wèi)玲.鐵皮石斛保健產(chǎn)品的研究開發(fā)價(jià)值[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥,2010:19(18):29.

[4] 雷文瑾.寒蘭組織培養(yǎng)中酚污染控制研究初探[J].南方園藝,2009,20(3):17-18.

[5] 武蕓.香樟愈傷組織的誘導(dǎo)和改良[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010,28(2):216-218.

[6] 張澤,武蕓.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)五鶴續(xù)斷組織培養(yǎng)的影響[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2010,28(2):219-221.

[7] 孫志蓉.鐵皮石斛試管苗生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)態(tài)研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,33(2):83-88.

[8] 劉會(huì)清，張愛(ài)香，常美花，等.春石斛蘭的莖段繁殖研究[J].北方園藝,2008(1):181-183.

[9] 張維民.石斛蘭生根培養(yǎng)過(guò)程污染的控制研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,36(2):113-114.