乙酸陰道熱敏凝膠劑在家兔陰道內的藥動學

田芳，成倩倩，俸靈林，王玉柱，李衛(wèi)華，丁訓誠

(1.上海市計劃生育科學研究所國家計劃生育藥具重點實驗室，上海200032;2.復旦大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生毒理學教研室，上海200032)

乙酸陰道熱敏凝膠劑在家兔陰道內的藥動學

田芳1，2，成倩倩1，2，俸靈林1，王玉柱1，李衛(wèi)華1，2，丁訓誠1

(1.上海市計劃生育科學研究所國家計劃生育藥具重點實驗室，上海200032;2.復旦大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生毒理學教研室，上海200032)

目的研究乙酸陰道熱敏凝膠劑經陰道給藥后藥物在家兔陰道內的藥代動力學特征，探索適合陰道用藥的新劑型。方法3 ml含乙酸36.23 mg的乙酸陰道熱敏凝膠劑推入家兔陰道內，給藥后0.25，0.5，1，1.5，2，4，8，12，16，20和24 h，對家兔陰道進行灌洗并測定灌洗液中乙酸的含量、用微電極插入陰道測定陰道pH值、取陰道組織勻漿后測定組織中乙酸含量。采用非線性最小二乘法進行計算機擬合獲得藥動學參數。結果乙酸陰道熱敏凝膠劑置入家兔陰道后，陰道pH值由給藥前中性(pH 6.67)轉變?yōu)樗嵝?pH 3.56)，陰道pH 3.5～4.0可保持約6 h;pH 3.5～4.5可保持約12 h;pH 3.5～5.0可保持19 h;給藥后24 h，pH值為5.32±0.24，乙酸含量為(0.38±0.15)g·L－1，為給藥量的11%。陰道組織中乙酸濃度峰值為600 μg·g－1，達峰時間為2 h，平均保留時間為7.73 h，藥物動力學參數符合二室模型。結論乙酸陰道熱敏凝膠劑符合陰道用藥的要求。

熱敏凝膠;醋酸;陰道;藥代動力學

生殖道感染是指由病原微生物和寄生蟲引起的生殖道疾病，已成為全球特別是發(fā)展中國家危害嚴重的生殖健康和公共衛(wèi)生問題［1］。目前，臨床用于治療細菌性陰道炎(bacterial vaginosis，BV)的措施主要是經口服或陰道局部給藥，盡管給予充分的抗生素治療后短期內有效，但停藥后BV的復發(fā)率仍然很高。特別值得注意的是，在BV復發(fā)的患者中存在持續(xù)的陰道高pH值(pH＞4.7)［2］，如果不能恢復正常pH，會促進BV復發(fā)，推測BV的發(fā)生或復發(fā)還與陰道微生物失衡有關。國外某些制藥公司研發(fā)一些非抗生素藥物，例如陰道酸性凝膠劑，用于恢復和維持陰道酸性，構建濕潤的陰道上皮保護膜，重建陰道正常的微生態(tài)平衡，增加陰道抗菌防御能力，并結合抗生素治療，可提高BV的治愈率與減少BV的復發(fā)［3－7］。

迄今為止，國內尚未制定陰道藥物局部藥代動力學(簡稱藥動學)研究的規(guī)范和評價標準。本文根據國外相關文獻［8］，初步探討了乙酸陰道熱敏凝膠劑在陰道局部的藥動學過程，以期為今后陰道用藥的局部藥動學研究方法提供參考。

同時，乙酸陰道熱敏凝膠劑選用乙酸為模型藥物，輔以熱敏凝膠新劑型，觀察其對家兔陰道給藥后，新劑型中乙酸在陰道局部的含量與pH值之間相關性、以及陰道組織中乙酸的動力學，為乙酸陰道熱敏凝膠劑進一步藥效學評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乙酸(廣東臺山市新寧制藥廠);泊洛沙姆407(德國BASSF公司);羥丙甲基纖維素(HPMC K4M，美國DOW公司);甘油(杭州油脂化工有限公司);乙酸陰道熱敏凝膠劑(自制，pH 3.5～3.7);苯甲酸雌二醇(蘇州市蘇瑞醫(yī)藥化工公司)。

Delta 320型精密數字pH計及100 μl微量電極配件(瑞士Mettler公司);酸堿滴定管(上海玻璃儀器廠);78-1A型磁力加熱攪拌器(上海電廣凡器材廠);XS205 Dual Range電子分析天平(瑞士Mettler公司);微量進樣器(上海醫(yī)用激光儀器廠)。

1.2 動物

封閉群日本大耳兔，雌性，76只，體質量(2.8±0.2)(±s)kg，動物許可證號:SCXK(滬)2002-0012，由上海市松江區(qū)松聯試驗動物場提供。

1.3 藥物配制

將處方量的HPMC和甘油加入到乙酸0.1 mol·L－1緩沖液(pH 3.6)中，攪拌溶解，然后加入處方量泊洛沙姆407(poloxamer407，P407)，攪拌使其分散均勻，置于4℃下至聚合物完全溶解，得到無色澄明的凝膠溶液。它能隨外界溫度由液態(tài)(≤28℃)轉變?yōu)槟z狀(≥29℃)。

1.4 乙酸含量及陰道pH值的測定［9］

氫氧化鈉酸堿滴定法測定乙酸含量，參照《中國藥典》2010年版二部“冰乙酸”中含量測定項。將家兔置仰臥位，將MI-4146P型微電極插入陰道2～3 cm處，靜置2～3 s后，測定陰道pH值。

1.5 生物樣品的采集及預處理

66只雌性家兔，給藥前注苯甲酸雌二醇0.1 mg，使家兔性周期同步。給藥時家兔置仰臥位，用12 cm長的聚乙烯彈性導尿管連接吸有3 ml(含乙酸36.23 mg)乙酸陰道熱敏凝膠劑的5 ml玻璃注射器，經插入家兔陰道內4～5 cm深處導尿管理推入凝膠。凝膠注入陰道后的0.25，0.5，1，1.5，2，4，8，12，16，20和24 h，吸新煮沸的預冷雙蒸水10 ml對各組家兔陰道進行灌洗，用咯痰接收管收集從陰道口流出的灌洗液全量，置15 ml離心管中，在4℃下，150×g離心15 min，全部上層液置具塞錐形瓶中，以備乙酸含量的檢測。

收集灌洗液后，耳靜脈空氣注入法處死家兔，取出陰道組織，去盡周圍結締組織，縱向切口陰道，用濾紙吸去表面水分，稱濕重，取適量陰道組織剪碎置入一定量新沸過的冷雙蒸水中，用高速勻漿器制成50%(W/V)組織勻漿，在4℃下，150×g離心15 min，取出全部上清液置－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 空白樣品的制備

10只雌性家兔分為2組。按1.5項制備未給藥家兔的陰道灌洗液和陰道組織上清液，5份用于制備標準曲線，5份加入乙酸分別配制6.0，25.0和45.0 g·L－1的陰道灌洗液和0.6，3.0和6.0 g·L－1的陰道組織樣品，以備方法學的驗證。

1.7 實驗結果數據采用±s表示。采用Stata8.0軟件及DAS藥動學軟件進行藥動學參數估算及統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 陰道灌洗液和組織中乙酸標準曲線的制備及檢測限的確定

2.1.1 陰道灌洗液中乙酸標準曲線的制備

精密稱取乙酸5，10，25，30和50 mg，加入到含10 ml新沸過的預冷雙蒸水的具塞錐形瓶中，搖勻后，按照酸堿滴定法，記錄消耗氫氧化鈉滴定液的量(ml)，采用最小二乘法進行線性回歸，采用Stata軟件測得工作曲線的線性方程:Y=6.0329X－0.9198〔R2=0.9970，X:氫氧化鈉滴定量(ml);Y:乙酸量(mg)〕。

2.1.2 陰道組織中乙酸標準曲線的制備

精密稱取乙酸0.4，0.8，1.9，3.8和7.0 mg，分別置于裝有上清液的具塞錐形瓶中，按酸堿滴定方法操作，記錄測得消耗NaOH滴定液的量(ml)，采用最小二乘法擬合校準標準曲線，采用Stata測得工作曲線的線性方程:Y=5.8258 X+0.0455〔R2=0.9968，X為氫氧化鈉滴定量(ml)，Y為乙酸量(mg)〕。

2.1.3 檢測限的確定

根據《中國藥典》非儀器分析目測法，本氫氧化鈉酸堿滴定條件下，乙酸的最低檢測量為0.16 mg。

2.2 乙酸在陰道灌洗液和陰道組織中的精密度和回收率

取制備好的陰道灌洗液和陰道組織上清液樣品，按乙酸含量的測定項操作，分別于一日內測定5次和每日測定1次，連續(xù)測5 d，計算日內、日間變異系數。由表1結果可見，各濃度陰道灌洗液和陰道組織上清液的日內變異系數＜3.2%和＜8.02%，日間變異系數＜3.26%和＜11.63%。樣本中乙酸回收率檢測下限時為83.1%，其他為90%～110%。

表1 乙酸在陰道灌洗液和陰道組織中的變異系數和回收率Tab.1 Precision and recovery of acetic acid in vaginal lavage and tissue

2.3 乙酸在陰道灌洗液和陰道組織中的回收率

取制備好的含不同濃度乙酸的陰道灌洗液和陰道組織上清液樣品，按前述乙酸含量的測定操作。結果空白陰道灌洗液和空白陰道組織上清液中3個濃度下的回收率分別為(100.9±2.9)%，(99.3±1.5)%，(98.3±2.7)%以及(83.1±5.4)%，(90.6±3.4)%，(92.1±5.2)%。

2.4 乙酸在陰道灌洗液和陰道組織液中的穩(wěn)定性

分別配制乙酸含量為25 g·L－1的陰道灌洗液和3.0 g·L－1的組織勻漿上清液，在室溫下放置，分別于0，2，4，6，8，12和24 h，按酸堿滴定法進行乙酸含量測定，計算其相對誤差。如表2所示，陰道灌洗液和陰道組織上清液中乙酸含量的相對標準差分別為3.9%和6.6%，乙酸含量無明顯變化，保持穩(wěn)定。

表2 乙酸在陰道灌洗液和陰道組織中的穩(wěn)定性Tab.2 Stability of acetic acid in vaginal lavage and tissue

2.5 乙酸陰道熱敏凝膠劑的藥動學

2.5.1 陰道灌洗液中乙酸陰道熱敏凝膠劑的藥動學

陰道灌洗液內乙酸濃度和陰道pH值呈負相關(圖1)。將所得灌洗液中的乙酸含量和陰道pH數據用Stata8.0軟件的Boxcox程序對殘留量和時間進行曲線擬合，得出:

根據式(1)和(2)分別計算出乙酸濃度和保留時間，見表3。

圖1 陰道灌洗液中乙酸濃度與陰道pH值的關系.±s，n=11.Fig.1 Correlation between pH of vaginal lavage fluid and acetic acid content.

表3 陰道灌洗液中乙酸濃度與陰道pH值的關系Tab.3 Correlation between retention content of acetic acid and pH value

由圖1和表3可見，乙酸陰道熱敏凝膠劑置入家兔陰道后，由中性pH值(6.67)立即轉化為酸性(pH=3.56)，以后pH值逐漸升高，在給藥后24 h家兔陰道pH值可達到5.32±0.24，此時相對應乙酸含量亦由3.62 g·L－1下降到0.38 g·L－1。說明，家兔陰道酸化程度與相應時間點的乙酸量密切相關。根據式(2)計算出乙酸陰道熱敏凝膠劑置入家兔陰道后，陰道pH 3.5～4.0可保持約6 h;陰道pH 3.5～4.5可保持約12 h;陰道pH 3.5～5.0可保持19 h，提示本品經陰道給藥后，能保持陰道酸性(pH≤5)的時間較持久，適合陰道用藥的要求。

2.5.2 乙酸陰道熱敏凝膠劑在陰道組織的藥動學

根據AIC法，陰道組織中乙酸藥物-時間曲線(藥-時曲線)以二室模型(圖2)為最佳組合，通過藥動學軟件(DAS)計算出的藥動學參數見表4。

圖2 陰道組織內乙酸的藥物-時間曲線.±s，n=11.Fig.2 Drug-time curve of acetic acid in vaginal tissue.

由表4可見，家兔經陰道給予乙酸陰道熱敏凝膠劑后，Tmax和cmax分別為2 h和600 μg·g－1，乙酸半衰期t1/2α為1.00 h，消除相半衰期t1/2β為12.44 h，消除速率常數小，平均滯留時間(0～24 h)為7.73 h。提示本品中乙酸能在陰道組織內蓄積，陰道組織中乙酸的消除與陰道黏膜表面乙酸的消失規(guī)律較一致，乙酸中H+可在較長時間內維持陰道的酸性環(huán)境。

表4 家兔經陰道給藥后乙酸的藥動學參數Tab.4 Pharmacokinetic parameters of acetic acid in rabbit vaginal tissue after vaginal administration

3 討論

本研究結果顯示，家兔陰道給予乙酸陰道熱敏凝膠劑3.0 ml(含乙酸36.23 mg)后12 h，乙酸含量為7.03 mg，為給藥量的19%，同時家兔陰道可保持pH 4.5的酸性環(huán)境;給藥后24 h，乙酸含量為給藥量的11%，陰道可保持pH 5.0的酸性微環(huán)境。本品乙酸陰道熱敏凝膠劑中乙酸在陰道保留時間的特點，與王成偉等［10］研制的溫度敏感性壬苯醇醚陰道用緩釋凝膠在大鼠陰道灌洗液中的壬苯醇醚含量變化十分相似。

與市售普通陰道凝膠劑相比，熱敏凝膠劑型可以顯著提高陰道內藥物的滯留性能［10］。Prudhome等［11］報道，一定濃度的P407溶液以球狀膠束包裹簡單立體網狀結構的形成存在。在室溫時，膠束間相對獨立，呈各向同性的牛頓流體，置入陰道后，P407隨著溫度的升高，膠束間堆砌和纏結，形成非牛頓流體。這種轉變與P407濃度有關，當P407濃度固定時，黏度的變化可受藥物及處方中添加劑的影響。當P407液體置入陰道后，發(fā)生相轉變，形成凝膠體系，在這一短暫的相變過程中，熱敏凝膠可以迅速鋪展并填充陰道黏膜皺褶的表面，黏附性佳，可延長藥物在陰道的保留時間，從而提高生物利用度。

計算所得各項參數表明，家兔陰道組織中乙酸含量的藥-時曲線符合二室模型，最大滯留濃度的峰值出現在給藥后2 h，消除相半衰期t1/2β為12.44 h，消除速率常數小，保持陰道的酸性(pH≤4.5)的平均保留時間達11.292 h。由實驗結果可以推測乙酸陰道熱敏凝膠劑中乙酸在陰道內的處置過程為:由熱敏凝膠與黏液形成的薄膜黏附在上皮細胞表面，延長酸化時間，也延緩藥物的釋放，達到延效和增效作用;此時，在凝膠中部分乙酸(HAc電解成的H+)不斷滲入黏膜下組織，有蓄積效應，對維持陰道低pH值的酸性環(huán)境起到重要作用，一部分H+和Ac－進入血管，被血液中的HCO3－/H2CO3緩沖對中和，因此實驗中家兔的外周血液中pH值始終保持穩(wěn)定。

眾所周知，陰道的酸性微環(huán)境和乳桿菌屬(Lactobacillus)等微生態(tài)的平衡是一種自身保護機制。因此，維持陰道酸性微環(huán)境是平衡陰道微生態(tài)最重要的因素之一［12］。反之則會導致陰道微生態(tài)失調，減輕陰道自身防御功能，從而誘發(fā)BV。本研究提示，乙酸陰道熱敏凝膠劑經陰道給藥后滯留性好，能保持陰道酸性(pH≤5)的時間較持久，適合陰道用藥的要求。

［1］Holt BY，Kilbourne-Brook M，Stone A，Harrison P，Shields WC.Multipurpose prevention technologies for sexual and reproductive health:gaining momentum and promise［J］.Contraception，2010，81(3):177-180.

［2］Milani M，Molteni B，Silvani I.Effect on vaginal pH of a polycarbophil vaginal gel compared with an acidic douche in woman with suspected bacterial vaginosis:a randomized，controlled study［J］.Cur Ther Res，2000，61(11):781-788.

［3］Fiorilli A，Molteni B，Milani M.Successful treatment of bacterial vaginosis with a policarbophil-carbopol acidic vaginal gel:results from a randomised double-blind，placebo-controlled trial［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2005，120(2):202-205.

［4］Williams DL，Newman DR，Ballagh SA，Creinin MD，Barnhart K，Weiner DH，et al.PhaseⅠsafety trial of two vaginal microbicide gels(Acidform or BufferGel)used with a diaphragm compared to KY jelly used with a diaphragm［J］.Sex Transm Dis，2007，34(12):977-984.

［5］Trottier S，Omar RF，Désormeaux A，Drouin J，Gagnon MT，Vezina F，et al.Safety，tolerance and acceptability of the Invisible Condom and its vaginal applicator in healthy women and their male sexual partners［J］.Contraception，2007，76(2):117-125.

［6］Harwell JI，Moench T，Mayer KH，Chapman S，Rodriguez I，Cu-Uvin S.A pilot study of treatment of bacterial vaginosis with a buffering vaginal microbicide［J］.J Womens Health(Larchmt)，2003，12(3):255-259.

［7］Paternoster DM，Tudor L，Milani M，Maggino T，Ambrosini A.Efficacy of an acidic vaginal gel on vaginal pH and interleukin-6 levels in low-risk pregnant women:a double-blind，randomized placebo-controlled trial［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2004，15(3):198-201.

［8］Paternoster DM，Tudor L，Milani M，Maggino T，Ambrosini A.Efficacy of an acidic vaginal gel on vaginal pH and interleukin-6 levels in low-risk pregnant women:a doubleblind，randomized placebo-controlled trial［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2004，15(3):198-201.

［9］Zeitlin L，Hoen TE，Achilles SL，Hegarty TA，Jerse AE，Kreider JW，et al.Tests of Buffergel for contraception and prevention of sexually transmitted diseases in animal models［J］.Sex Transm Dis，2001，28(7):417-423.

［10］王成偉，唐星，王曉梅，田曉琳，李真.溫度敏感性壬苯醇醚陰道用緩釋凝膠的制備與評價［J］.中國新藥雜志，2006，15(4):280-284.

［11］Prudhome RK，Wu G，Schneider DK.Structure and rheology studies of poly(oxyethylene-oxypropylene-oxyethylene)aqueous solution［J］.Langmuir，1996，12(20):4651-4659.

［12］Boskey ER，Telsch KM，Whaley KJ，Moench TR，Cone RA.Acid production by vaginal flora in vitro is consistent with the rate and extent of vaginal acidification［J］.Infect Immun，1999，67(10):5170-5175.

Pharmacokinetics of acetic acid thermoreversible vaginal gel in rabbits vagina

TIAN Fang1，2，CHENG Qian-qian1，2，FENG Ling-lin1，WANG Yu-zhu1，LI Wei-hua1，2，DING Xun-cheng1
(1.National Laboratory of Drugs and Devices for Family Planning，Shanghai Institute of Planned Parenthood
Research，Shanghai200032，China;2.Department of Occupational Health and Toxicology，School of Public Health，Fudan University，Shanghai200032，China)

OBJECTIVETo investigate the pharmacokinetics of acetic acid thermoreversible gel(Ace-Acid Gel)in rabbits vagina.METHODSThree microliter Ace-Acid Gel(containing 36.23 mg acetic acid)was given to the 66 rabbits through vagina.At 0.25，0.5，1，1.5，2，4，8，12，16，20 and 24 h after administration，acetic acid content in rabbit vaginal lavage fluid and in homogenated vaginal tissues were measured.Vaginal pH was detected with a microelectrode inserted into the vagina，and pharmacokinetic parameters were calculated using nonlinear least squares fitting model.RESULTSAfter Ace-Acid Gel administration，vaginal pH changed from neutral(pH 6.67)to acidic(pH 3.56).The pH value was maintained at 3.5－4.0 for 6 h，at 3.5－4.5 for 12 h，and at 3.5－5.0 for 19 h.At 24 h，the pH value was 5.32±0.24 and the acetic acid content was(0.38±0.15)g·L－1(11%of administered dose).The concentration-time curve fitted in with the two-compartment model.The peak concentration(cmax)of acetic acid in vaginal tissue was 600 μg·g－1，peak time(Tmax)was 2 h，and the mean residence time(MRT0－24)was 7.73 h.CONCLUSIONThe new formulation is suitable for vaginal delivery.

thermoreversible gel;acetic acid;vagina;pharmacokinetics

The project supported by National Science and Technology Major Project(2008ZX1001-015);the Elevnth Five-Year Plan National Key Technology Research and Development Program(2006BAI03B09);Foundation of Shanghai Population and Family Planning Commission(2009JG06);and Foundation of Shanghai Committee of Science and Technology(1052nm05600)

R969.1，R984

A

1000-3002(2011)05-0469-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2011.05.010

國家科技重大專項(2008ZX1001-015);十一五科技支撐項目(2006BAI03B09);上海市人口與計劃生育委員會項目(2009JG06);上海市科學技術委員會項目(1052nm05600)

田芳(1985－)，女，碩士，主要從事生殖毒理學研究。

李衛(wèi)華，E-mail:imliweihua@yahoo.com，Tel:(021)64171045，Fax:(021)64046128

Correspondence author:LI Wei-hua，E-mail:imliweihua@yahoo.com，Tel:(021)65171045，Fax:(021)64046128

2011-01-27接受日期:2011-05-23)

(本文編輯:付良青)