地塞米松和淀粉樣β蛋白片段25－35對(duì)PC12細(xì)胞損傷和凋亡的影響

李維祖，張文，李俠，尹艷艷，李衛(wèi)平，3

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，抗炎免疫藥理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230032;2.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院藥劑科，安徽蕪湖230000;3.安慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校，安徽安慶246003)

地塞米松和淀粉樣β蛋白片段25－35對(duì)PC12細(xì)胞損傷和凋亡的影響

李維祖1，張文2，李俠1，尹艷艷1，李衛(wèi)平1，3

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，抗炎免疫藥理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230032;2.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院藥劑科，安徽蕪湖230000;3.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽安慶246003)

目的探討地塞米松(DEX)和淀粉樣β蛋白片段25-35(Aβ25-35)聯(lián)合作用對(duì)PC12細(xì)胞損傷和凋亡的影響。方法采用單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用DEX 0.1～10 μmol·L-1和Aβ25-351～5 μmol·L-1作用PC12細(xì)胞24 h，MTT法測(cè)定細(xì)胞活力;膜聯(lián)蛋白-Ⅴ，PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡峰;逆轉(zhuǎn)錄-PCR檢測(cè)胱天蛋白酶3 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果MTT結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，DEX 5和10 μmol·L-1，Aβ25-351，5和10 μmol·L-1，DEX 5+Aβ25-351，5和10 μmol·L-1及DEX 10+Aβ25-355，10 μmol·L-1組均可明顯降低PC12細(xì)胞存活率，而DEX聯(lián)合Aβ25-35能明顯減少PC12細(xì)胞數(shù)(P＜0.01)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，DEX 5 μmol·L-1和Aβ25-351 μmol·L-1單獨(dú)作用對(duì)PC12細(xì)胞凋亡率和亞二倍體凋亡峰有一定的增加作用(P＜0.05)，兩者聯(lián)合作用能明顯增加PC12細(xì)胞早期和中晚期凋亡率，增加亞二倍體凋亡峰(P＜0.01);RT-PCR結(jié)果顯示，DEX 5 μmol·L-1和Aβ25-351 μmol·L-1單獨(dú)作用對(duì)PC12細(xì)胞胱天蛋白酶3 mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響，它們聯(lián)合作用能明顯增加PC12細(xì)胞胱天蛋白酶3 mRNA的表達(dá)水平(P＜0.05)。結(jié)論DEX和Aβ25-35聯(lián)合作用能明顯增加對(duì)PC12細(xì)胞的損傷，促進(jìn)胱天蛋白酶3 mRNA表達(dá)，誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡。

地塞米松;淀粉樣β蛋白;阿爾茨海默病;細(xì)胞凋亡

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是當(dāng)前引起中、老年人智力降低、癡呆的最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其病理學(xué)特征為淀粉樣β蛋白(amyloid beta protein，Aβ)聚集形成的老年斑(senile plaque，SP)，tau蛋白異常聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle，NFT)，腦皮質(zhì)、海馬神經(jīng)元有不同程度的減少等。AD的發(fā)病原因還不完全清楚，早在20世紀(jì)90年代初就發(fā)現(xiàn)AD與下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(hypothalamic-pituitary-adrenocortical，HPA)軸功能失調(diào)有關(guān)。在AD患者中存在HPA軸的功能失調(diào)，主要表現(xiàn)為循環(huán)中的基礎(chǔ)糖皮質(zhì)激素水平顯著升高［1］和地塞米松(dexamethasone，DEX)激發(fā)后皮質(zhì)醇抑制失敗等［2］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激和糖皮質(zhì)激素水平的升高能夠影響海馬神經(jīng)元樹突的完整性［3-4］，也可以促進(jìn)海馬神經(jīng)元的死亡［5］。應(yīng)激水平糖皮質(zhì)激素能夠明顯升高轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠腦組織勻漿可溶性Aβ1-40和Aβ1-42水平，同時(shí)也能夠增加不溶性Aβ1-42水平［6-7］。前期研究表明，應(yīng)激水平的DEX能引起小鼠學(xué)習(xí)記憶功能下降，對(duì)小鼠腦皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)元具有一定的損傷作用［8］。由于糖皮質(zhì)激素水平和Aβ含量增加對(duì)神經(jīng)元都有毒性作用，而DEX和Aβ聯(lián)合應(yīng)用對(duì)神經(jīng)元的損傷作用目前國(guó)內(nèi)外研究較少。為了進(jìn)一步研究DEX和Aβ聯(lián)合作用對(duì)神經(jīng)元的影響，本實(shí)驗(yàn)觀察了在體外DEX和Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞損傷及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、藥品和試劑

PC12細(xì)胞株由安徽中醫(yī)學(xué)院李慶林教授惠贈(zèng)。DEX，Aβ25-35，四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲亞砜(DMSO)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;DMEM、胰酶-EDTA混合物為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;青霉素(醫(yī)用粉劑)為哈藥集團(tuán)總廠產(chǎn)品;鏈霉素(醫(yī)用粉劑)為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品。胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品;膜聯(lián)蛋白(Annexin)-Ⅴ/PI雙染試劑盒和PI單染試劑為凱基生物有限公司產(chǎn)品;Trizol為德國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品。焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)為上海索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品;RT試劑盒為TaKaRa大連寶生物公司產(chǎn)品。胱天蛋白酶3和β肌動(dòng)蛋白引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;DNA標(biāo)志物DL100為天根生化科技有限公司產(chǎn)品;PCR試劑盒為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱，香港利康公司;超凈工作臺(tái)，蘇州凈化公司;倒置生物顯微鏡，重慶光電公司;FAl004型電子天平，上海天平儀器廠;756MC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;SpectraMax 190型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)MD公司;TGL-16H高速低溫離心機(jī)，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司;PHS-3C精密PH計(jì)，上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司;電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械廠;PCR儀，Bio-Rad公司;Biosens SC810凝膠成像系統(tǒng)，上海山富科學(xué)儀器有限公司;流式細(xì)胞儀EPICSXL，美國(guó)庫(kù)爾特公司;96孔和6孔培養(yǎng)板，美國(guó)Costar公司;Winmdi29流式細(xì)胞儀分析軟件，美國(guó)Tonec公司。

1.3 MTT法測(cè)定PC12細(xì)胞存活

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期密度為1×108L-1細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，再加100 μl DMEM完全培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔。按照分組分別加入含10%血清和雙抗的DMEM(正常對(duì)照);DEX 0.1，1，5和10 μmol·L-1;Aβ25-351，5和10 μmol·L-1;DEX 5+Aβ25-351，5和10 μmol·L-1;DEX 10+Aβ25-355和10 μmol·L-1。

CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，24 h貼壁后，吸出原培養(yǎng)液，用D-Hank液洗2次，換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液孵育24 h，使細(xì)胞同步化于G0/G1期。各用藥組換含有相應(yīng)藥物的DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組換含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，觀察24 h細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每孔加入20 μl MTT溶液5 g·L-1，37℃孵育4 h后，小心吸棄培養(yǎng)板中的液體，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10～15 min，使結(jié)晶物充分溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處吸光度(absorbance，A)。細(xì)胞存活率按公式:細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%計(jì)算。

1.4 PC12細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

1.4.1 細(xì)胞分組

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期密度為3×1011L-1接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 ml，再加1 ml培養(yǎng)基(含10%血清的DMEM完全培養(yǎng)基)，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。按照分組，分別加入加含10%血清和雙抗的DMEM(正常對(duì)照);DEX 5 μmol·L-1，Aβ25-351 μmol·L-1，DEX 5 μmol·L-1+Aβ25-351 μmol·L-1，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，24 h貼壁后，血清饑餓法，使細(xì)胞同步化于G0/G1期。各用藥組換含有相應(yīng)藥物的DMEM培養(yǎng)基，正常對(duì)照組換含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，觀察24 h細(xì)胞生長(zhǎng)情況，拍照，每孔計(jì)數(shù)3個(gè)高倍視野平均細(xì)胞數(shù)。

1.4.2 膜聯(lián)蛋白-Ⅴ/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取上述分組處理的細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化收集離心，用PBS洗滌細(xì)胞2次(111.9×g，5 min)收集3×108細(xì)胞，加入500 μl的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞;加入5 μl膜聯(lián)蛋白Ⅴ-FITC混勻后，加入5 μl PI，混勻;室溫、避光、反應(yīng)5～15 min;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm;發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Winmdi29分析軟件進(jìn)行分析早期和中晚期PC12細(xì)胞凋亡率。

1.4.3 PI單染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡峰

取上分組處理的細(xì)胞，PI單染流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡峰，具體步驟如下:用0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞1×109L-1，111.9×g，離心5 min，棄去培養(yǎng)液。2 ml D-Hank洗滌1次。離心去D-Hank，向試管內(nèi)加2.5 ml生理鹽水，重新懸浮細(xì)胞，然后緩慢加入-20℃預(yù)冷的95%乙醇7.5 ml，4℃固定1 h。離心棄去固定液，用D-Hank洗1次，調(diào)細(xì)胞密度1×106，加1 ml PI重懸混勻。置4℃冰箱，染色20～30 min。離心洗PI染液，加少許PBS液。用流式細(xì)胞儀檢測(cè):PI用氬離子激發(fā)熒光，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)630 nm，產(chǎn)生紅色熒光，分析PI熒光強(qiáng)度的直方圖。用Winmdi29分析軟件分析PC12細(xì)胞凋亡峰。

1.4.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)胱天蛋白酶3 mRNA的表達(dá)水平

取上述分組處理的細(xì)胞，Trizol法提取PC12細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280值在1.8～2.0之間。取1 μg總RNA于42℃逆轉(zhuǎn)錄1 h后，以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，進(jìn)行PCR。引物序列及片段長(zhǎng)度:β肌動(dòng)蛋白，上游引物5'-GAGACCTT CAACACCCCAGCG-3'，下游引物5'-TCGGGGCATCGGAAC-CGCTCA-3'，606 bp;胱天蛋白酶3，上游引物5'-AAGCCGAAACTCTTCATC-3'，下游引物5'-TGAGC ATTGACACAATACAC-3'，349 bp。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min;95℃變性40 s，52℃復(fù)性40 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增38個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，將電泳圖像輸入凝膠分析系統(tǒng)，進(jìn)行條帶吸光度(absorbance，A)掃描，結(jié)果以各目的條帶與對(duì)應(yīng)β肌動(dòng)蛋白的A比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DEX和Aβ25－35對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組細(xì)胞存活率相比，單獨(dú)給予DEX 0.1和1 μmol·L-1對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)影響;單獨(dú)給予DEX 5和10 μmol·L-1，Aβ25-351，5和10 μmol·L-1細(xì)胞存活率有一定的降低(P＜0.05)，而DEX 5+Aβ25-351，5，10 μmol·L-1，和DEX 10+Aβ25-355，10 μmol·L-1組均可顯著降低PC12細(xì)胞存活率(P＜0.01)，表明DEX和Aβ25-35聯(lián)合對(duì)PC12細(xì)胞具有明顯的損傷作用。

表1 地塞米松(DEX)和淀粉樣β蛋白片段25－35(Aβ25－35)對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響Tab.1 Effect of dexamethasone(DEX)and amyloid beta protein fragment 25－35(Aβ25－35)on PC12 cell survival

2.2 DEX和Aβ25－35對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞數(shù)目的影響

圖1和表2結(jié)果顯示，正常對(duì)照組PC12細(xì)胞貼壁，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，很多細(xì)胞伸出明顯突起，呈三角形或多邊形。與正常對(duì)照組比較，DEX 5 μmol·L-1和Aβ25-351 μmol·L-1組細(xì)胞出現(xiàn)突起減少，細(xì)胞數(shù)目變少(P＜0.05)。DEX 5+Aβ25-351 μmol·L-1組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的皺縮、變形、細(xì)胞突起減少、細(xì)胞數(shù)目減少等(P＜0.01)。

圖1 DEX和Aβ25－35對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響(×400).A:正常對(duì)照組;B:DEX 5 μmol·L-1;C:Aβ25-35 1 μmol·L-1;D:DEX 5 μmol·L-1+Aβ25-351 μmol·L-1.Fig.1 Effect of DEX and Aβ25－35on the morphology changes in PC12 cells(×400).

表2 DEX和Aβ25－35對(duì)PC12細(xì)胞數(shù)目的影響Tab.2 Effect of DEX and Aβ25－35on number of PC12 cell

2.3 DEX和Aβ25－35對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響

由圖2和圖3膜聯(lián)蛋白-Ⅴ/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組PC12細(xì)胞早期和中晚期凋亡細(xì)胞均較少。與正常對(duì)照組比較，DEX 5 μmol·L-1，Aβ25-351 μmol·L-1和DEX 5+Aβ25-351 μmol·L-1均能增加PC12細(xì)胞的凋亡率，其中DEX 5+Aβ25-351 μmol·L-1組PC12細(xì)胞早期和中晚期凋亡率有明顯的增加作用(P＜0.01)。

PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖3和表3)顯示，正常對(duì)照組的凋亡峰較小，與對(duì)照組比較，DEX 5 μmol·L-1，Aβ25-351 μmol·L-1和DEX 5+Aβ25-351 μmol·L-1均能增加PC12細(xì)胞的凋亡峰，其中DEX 5+Aβ25-351 μmol·L-1對(duì)PC12細(xì)胞凋亡峰具有明顯的增加作用(P＜0.01)。

圖2 FITC-膜聯(lián)蛋白/碘化丙啶(PI)雙染檢測(cè)DEX和Aβ25－35對(duì)PC12細(xì)胞凋亡率的影響.A:正常對(duì)照組;B:DEX 5 μmol·L-1;C:Aβ25-351μmol·L-1;D:DEX 5+Aβ25-35 1 μmol·L-1.Fig.2 Effect of DEX and Aβ25－35on the apoptotic rate in PC12 cells.

圖3 PI單染檢測(cè)DEX和Aβ25－35對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響.A:正常對(duì)照組;B:DEX 5 μmol·L-1;C:Aβ25-351 μmol·L-1;D:DEX 5 μmol·L-1+Aβ25-351 μmol·L-1.Fig.3 Effect of DEX and Aβ25－35on apoptosis in PC12 cells.

表3 DEX和Aβ25－35對(duì)PC12細(xì)胞凋亡率的影響Tab.3 Effect of DEX and Aβ25－35on apoptosis in PC12 cells

2.5 DEX和Aβ25－35對(duì)PC12細(xì)胞胱天蛋白酶3 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR分析顯示，與正常對(duì)照組比較，DEX 5 μmol·L-1和Aβ25-351 μmol·L-1單獨(dú)作用對(duì)胱天蛋白酶3 mRNA表達(dá)沒(méi)有明顯影響，DEX 5 μmol·L-1聯(lián)合Aβ25-351 μmol·L-1對(duì)胱天蛋白酶3 mRNA的表達(dá)有明顯的增加作用(P＜0.05)(圖4和表4)。

圖4 DEX和Aβ25－35對(duì)PC12細(xì)胞胱天蛋白酶3 mRNA水平的影響.M:DL100標(biāo)志物;泳道1:正常對(duì)照組;泳道2:DEX 5 μmol·L-1;泳道3:Aβ25-351 μmol·L-1;泳道4:DEX 5+Aβ25-35 1 μmol·L-1.Fig.4 Effect of DEX and Aβ25－35on caspase 3 mRNA level in PC12 cells.

表4 DEX和Aβ25－35對(duì)PC12細(xì)胞胱天蛋白酶3 mRNA水平的影響Tab.4 Effect of DEX and Aβ25－35on caspase 3 mRNA level in PC12 cells

3 討論

本研究結(jié)果顯示，DEX和Aβ25-35單獨(dú)作用或DEX和Aβ25-35合用均可降低PC12細(xì)胞活力;DEX和Aβ25-35單獨(dú)作用或DEX和Aβ25-35合用均可明顯增加PC12細(xì)胞的凋亡率。DEX和Aβ25-35單獨(dú)作用對(duì)PC12細(xì)胞中胱天蛋白酶3 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響，但兩者合用則可明顯增加PC12細(xì)胞中胱天蛋白酶3 mRNA水平。

大量的研究證實(shí)，糖皮質(zhì)激素水平和Aβ含量的增加對(duì)神經(jīng)元均具有毒性作用［9-10］，AD患者血漿糖皮質(zhì)激素水平明顯高于正常人群［1］，慢性心理應(yīng)激可以增加AD的發(fā)病率［11］。表明糖皮質(zhì)激素水平的升高和Aβ的毒性作用在AD的發(fā)生和發(fā)展中都具有重要的作用，可見(jiàn)糖皮質(zhì)激素和Aβ對(duì)AD患者可以產(chǎn)生聯(lián)合損傷作用。聯(lián)合作用的主要類型有協(xié)同作用、相加作用和拮抗作用等，如果DEX和Aβ的聯(lián)合損傷作用具有協(xié)同或相加作用可能會(huì)促進(jìn)AD的發(fā)生和發(fā)展，因此研究糖皮質(zhì)激素和Aβ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的是否具有協(xié)同或相加損傷作用有重要意義。

本研究結(jié)果表明，DEX和Aβ25-35單獨(dú)作用或聯(lián)合作用對(duì)PC12細(xì)胞均有一定的損傷作用。與相同劑量的DEX和Aβ25-35單獨(dú)作用比較，DEX和Aβ25-35聯(lián)合作用可以進(jìn)一步降低PC12細(xì)胞活力、增加細(xì)胞凋亡率，明顯增加PC12細(xì)胞中胱天蛋白酶3 mRNA水平，但差異沒(méi)有顯著性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體外DEX和Aβ25-35聯(lián)合作用對(duì)PC12細(xì)胞可能沒(méi)有協(xié)同損傷作用，DEX和Aβ25-35聯(lián)合損傷是否具有相加作用還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。另外由于PC12細(xì)胞是來(lái)自大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞株，關(guān)于DEX和Aβ25-35對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的聯(lián)合損傷作用及其機(jī)制有待于在海馬神經(jīng)元和整體動(dòng)物上做進(jìn)一步研究。

［1］Csernansky JG，Dong H，F(xiàn)agan AM，Wang L，Xiong C，Holtzman DM，et al.Plasma cortisol and progression of dementia in subjects with Alzheimer-type dementia［J］.Am J Psychiatry，2006，163(12):2164-2169.

［2］N?sman B，Olsson T，Viitanen M，Carlstr?m K.A subtle disturbance in the feedback regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in the early phase of Alzheimer's disease［J］.Psychoneuroendocrinology，1995，20(2):211-220.

［3］Kleen JK，Sitomer MT，Killeen PR，Conrad CD.Chronic stress impairs spatial memory and motivation for reward without disrupting motor ability and motivation to explore［J］.Behav Neurosci，2006，120(4):842-851.

［4］Conrad CD，McLaughlin KJ，Harman JS，F(xiàn)oltz C，Wieczorek L，Lightner E，et al.Chronic glucocorticoids increase hippocampal vulnerability to neurotoxicity under conditions that produce CA3 dendritic retraction but fail to impair spatial recognition memory［J］.J Neurosci，2007，27(31):8278-8285.

［5］MacPherson A，Dinkel K，Sapolsky R.Glucocorticoids worsen excitotoxin-induced expression of pro-inflammatory cytokines in hippocampal cultures［J］.Exp Neurol，2005，194(2):376-383.

［6］Green KN，Billings LM，Roozendaal B，McGaugh JL，LaFerla FM.Glucocorticoids increase amyloid-beta and tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease［J］.J Neurosci，2006，26(35):9047-9056.

［7］Dong H，Yuede CM，Yoo HS，Martin MV，Deal C，Mace AG，et al.Corticosterone and related receptor expression are associated with increased beta-amyloid plaques in isolated Tg2576 mice［J］.Neuroscience，2008，155(1):154-163.

［8］Li WZ，Li WP，Yao YY，Zhang W，Yin YY，Wu GC，et al.Glucocorticoids increase impairments in learning and memory due to elevated amyloid precursor protein expression and neuronal apoptosis in 12-month old mice［J］.Eur J Pharmacol，2010，628(1-3):108-115.

［9］Ge YS，Teng WY，Zhang CD.Protective effect of cyclophilin A against Alzheimer's amyloid beta-peptide(25-35)-induced oxidative stress in PC12 cells［J］.Chin Med J(Engl)，2009，122(6):716-724.

［10］Davis KL，Davis BM，Greenwald BS，Mohs RC，Mathé AA，Johns CA，et al.Cortisol and Alzheimer's disease.Ⅰ:Basal studies［J］.Am J Psychiatry，1986，143(3):300-305.

［11］Johansson L，Guo X，Waern M，Ostling S，Gustafson D，Bengtsson C，et al.Midlife psychological stress and risk of dementia:a 35-year longitudinal population study［J］.Brain，2010，133(Pt 8):2217-2224.

Effect of dexamethasone and amyloid beta protein fragment 25－35 on PC12 cells injury and apoptosis

LI Wei-zu1，ZHANG Wen2，LI Xia1，YIN Yan-yan1，LI Wei-ping1，3
(1.Department of Pharmacology，Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immunopharmacology，Ministry of Education，Key Laboratory of Chinese Medicine Research and Development，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Anhui Medical University，Hefei230032，China;2.Department of Pharmacy，Yijishan Hospital，Wannan Medical University，Wuhu241001，China;3.Anqing Medical and Pharmaceutical College，Anqing246003，China)

OBJECTIVETo study the effect of dexamethasone(DEX)and amyloid beta protein fragment 25-35(Aβ25-35)on PC12 cells injury and apoptosis.METHODSDEX 0.1-10 μmol·L-1and Aβ25-351-5 μmol·L-1were administered alone or in combination to PC12 cells.PC12 cells survival was detected by MTT assay.PC12 cells apoptosis was detected by flow cytometer with Annexin-Ⅴ/PI double stain and PI single stain.Caspase 3 m RNA level in PC12 cells was detected by RT-PCR.RESULTSMTT results showed that，DEX 5，10 μmol·L-1，Aβ25-351，5，10 μmol·L-1，DEX 10+Aβ25-351，5，10 μmol·L-1and DEX 5+Aβ25-355 and 10 μmol·L-1could decrease PC12 cells survival after 24 h treatment.While combination of DEX with Aβ25-35could significantly decrease PC12 cells number(P＜0.01).DEX 5 μmol·L-1，Aβ25-351 μmol·L-1could increase the apoptotic rate of PC12 cells.And DEX 5+Aβ25-351 μmol·L-1could significantly increase the apoptotic rate of PC12 cells(P＜0.01).Single DEX 5 or Aβ25-351 μmol·L-1had no significant effect on caspase 3 mRNA levels，but DEX 5 μmol·L-1+Aβ25-351 μmol·L-1could significantly increase caspase 3 mRNA levels.CONCLUSIONCombination of DEX with Aβ25-35can significantly increase the injury and apoptosis in PC12 cells.

dexamethasone;amyloid beta protein;Alzheimer's disease;apoptosis

The project supported by Foundations of Academic Leader of Anhui Province(2005hbz18);the Foundations of Talented Man of Anhui Province(2007Z030);Natural Science Foundations of Education Bureau of Anhui Province(KJ2009A81);and Natural Science Foundations of Education Bureau of Anhui Province(KJ2010B378)

LI Wei-ping，E-mail:lwp19@126.com，Tel:(0551)5161133

R966

A

1000-3002(2011)05-0430-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2011.05.004

安徽省高校省學(xué)術(shù)帶頭人科學(xué)研究資助(2005hbz18);安徽省人才基金(2007Z030);安徽省教育廳自然科學(xué)項(xiàng)目(KJ2009A81);安徽省教育廳自然科學(xué)項(xiàng)目(KJ2010B378)

作者介紹:李維祖(1971-)，男，副教授，博士，主要從事神經(jīng)免疫藥理學(xué)研究;李衛(wèi)平(1960-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)免疫藥理學(xué)研究。

李衛(wèi)平，E-mail:lwp19@126.com，Tel:(0551)5161133

(來(lái)稿日期:2010-12-06接受日期:2011-07-01)

(本文編輯:喬虹)