urantide抑制動脈粥樣硬化大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1的表達(dá)

趙娟

(承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北承德067000)

urantide抑制動脈粥樣硬化大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1的表達(dá)

趙娟

(承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北承德067000)

目的研究urantide對動脈粥樣硬化(AS)大鼠胸主動脈及血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達(dá)的影響。方法(1)在體實(shí)驗(yàn):采用給予高脂飲食及ip給予維生素D3制備AS模型。AS大鼠分別尾靜脈注射urantide 30 μg·kg-1·d-1，分為3，7和14 d組。于各實(shí)驗(yàn)結(jié)束時間點(diǎn)測量體質(zhì)量，檢測血中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和Ca2+;免疫組化法檢測胸主動脈中MCP-1表達(dá)。(2)體外實(shí)驗(yàn):貼塊法制備的血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中加入尾加壓素Ⅱ(UⅡ)10 μmol·L-1+urantide 0.1，1，10 nmol·L-1，0.1和1 μmol·L-1作用48 h，ELISA法檢測細(xì)胞中MCP-1含量。結(jié)果(1)在體實(shí)驗(yàn):與AS模型組比較，只有14 d urantide給藥組的體質(zhì)量顯著增加(P＜0.05);3 d組、7 d組及14 d組血清中Ca2+，TG，TC，HDL及LDL均隨給藥時間的延長呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(P＜0.01)，達(dá)到或接近陽性藥氟伐他汀組水平;在大鼠胸主動脈內(nèi)膜及中膜斑塊內(nèi)，與AS模型對照組相比，urantide 3 d組、7 d組及14 d組MCP-1陽性染色強(qiáng)度和范圍均減少。(2)體外實(shí)驗(yàn):urantide各濃度組對VSMC培養(yǎng)上清中MCP-1的表達(dá)均有下調(diào)趨勢(P＜0.05)。結(jié)論urantide在大鼠動脈粥樣硬化中可抑制炎癥因子MCP-1的表達(dá)。

urantide;尾加壓素Ⅱ;單核細(xì)胞趨化蛋白-1;動脈粥樣硬化;血管平滑肌細(xì)胞

尾加壓素Ⅱ(urotensinⅡ，UⅡ)作為目前收縮血管活性最強(qiáng)的活性肽，同時又是一種強(qiáng)烈的絲裂原，它在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)中的病理生理意義越來越受到人們的重視。因此，對UⅡ及其受體的直接干預(yù)，可能為治療AS提供新的策略和手段［1］。urantide是在hUⅡ基礎(chǔ)上衍生的肽類UⅡ受體拮抗劑，其能競爭性地拮抗UⅡ?qū)Υ笫笮刂鲃用}收縮作用及對血管壁細(xì)胞的促絲裂作用［2］。單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)是炎癥反應(yīng)最強(qiáng)的單核細(xì)胞趨化因子，在正常血管壁中幾乎未見表達(dá)，而在AS損傷部位則有MCP-1產(chǎn)生，促進(jìn)AS的發(fā)生［3-4］。UⅡ和炎癥因子MCP-1都是促AS發(fā)生、發(fā)展的重要因素。urantide在拮抗UⅡ收縮作用的同時，是否對炎癥因子MCP-Ⅰ的表達(dá)也具有一定的作用，這對于明確AS中UⅡ與炎癥介質(zhì)之間相互作用機(jī)制有重要的實(shí)驗(yàn)意義。因此，本研究利用大鼠AS模型和體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)，探討在urantide干預(yù)下，AS大鼠胸主動脈及VSMC中MCP-1表達(dá)的變化，為臨床防治AS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

urantide由上海華大天源生物科技有限公司合成;氟伐他汀(fluvastatin，F(xiàn)lu)購自北京諾華制藥有限公司;DMEM培養(yǎng)基干粉及UⅡ2購自美國Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自天津?yàn)蠊?α肌動蛋白抗體(anti-actin α，α-SMA)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;山羊抗大鼠MCP-1多克隆抗體購自北京中杉公司;生物素標(biāo)記小鼠抗山羊IgG購自武漢博士德生物工程公司;SABC免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.2 在體實(shí)驗(yàn)

1.2.1 動物、模型制備及分組

高脂飼料的配制:基礎(chǔ)飼料，3.5%膽固醇，10%豬油，0.2%丙硫氧嘧啶，0.5%膽酸鈉和5%白糖。

健康雄性Wistar大鼠，160只，體質(zhì)量180～200 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部動物部提供〔許可證號:SCXK(吉)-2009-0004〕。除25只大鼠作為正常對照組給予正常飼料外，其余125只Wistar大鼠，飼以高脂飼料基礎(chǔ)上，每天ip給予維生素D3(vitamin D3，Vit D3)70 U·kg-1，連續(xù)3 d。實(shí)驗(yàn)周期為6周。HE染色，觀察大鼠胸主動脈形態(tài)學(xué)改變。

AS模型復(fù)制成功后，AS模型組再隨機(jī)分3組:模型組(25只)、陽性藥氟伐他汀組(25只)、urantide組(75只，每個時間點(diǎn)各25只)。正常對照組和模型組每日尾靜脈注射生理鹽水30 μg·kg-1，連續(xù)14 d;氟伐他汀組每日ig給予氟伐他汀5 μg·kg-1，連續(xù)14 d;urantide組，每日尾靜脈注射urantide 30 μg·kg-1，分別持續(xù)3，7和14 d。

1.2.2 血脂及血Ca2+濃度檢測

分別在實(shí)驗(yàn)開始時、給藥前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時進(jìn)行血標(biāo)本采集。采集方法:各組動物禁食過夜，大鼠用0.3%戊巴比妥30 mg·kg-1ip給予麻醉后，分離胸主動脈，用5 ml注射器采集動脈血，用1006×g。離心15 min，吸取血清分裝于Eppendorf管中，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。全自動生化分析儀檢測大鼠血清中的甘油三酯(triglycerides，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和Ca2+的含量。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色檢測胸主動脈MCP-1表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，取胸主動脈約為1 cm，用4%多聚甲醛固定，留做組織學(xué)檢測之用。采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色，按試劑盒操作說明進(jìn)行，一抗滴加的山羊抗大鼠MCP-1多克隆抗體按1∶100比例稀釋，新鮮配置的DAB顯色液，室溫下顯色3～5 min，復(fù)染，封片。每張切片隨機(jī)選取10個高倍鏡視野(×400)，用Introduction to Image-Proplus 6.0病理圖像分析軟件對所選視野內(nèi)的免疫組化陽性信號進(jìn)行圖像分析，計(jì)算各組大鼠胸主動脈陽性信號的平均吸光度值(absorbance，A)。

1.3 體外實(shí)驗(yàn)

1.3.1 血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)

健康雄性Wistar大鼠采用貼塊法進(jìn)行血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)原代培養(yǎng)。步驟:①大鼠經(jīng)乙醚麻醉后，迅速將胸主動脈自體內(nèi)取出，立即放入75%乙醇中，移入無菌超凈工作臺;②將動脈剪成長2～3 cm的小段，去除外膜的血管放入培養(yǎng)皿中，縱向剪開管壁，然后用刀片輕輕刮除內(nèi)膜，將中膜剪成1 mm3左右的小塊，用彎吸管均勻接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃條件下培養(yǎng)2～4 h;③待組織塊牢固貼壁，沿側(cè)壁緩慢加入含有10%胎FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于CO2孵箱靜止培養(yǎng)3 d后，觀察換液。至細(xì)胞呈單層匯合后進(jìn)行傳代。

1.3.2 ELISA法檢測上清中MCP-1的含量

對數(shù)生長期細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度約為1×107L-1接種至24孔板。待細(xì)胞80%融合后，加入含0.5%血清培養(yǎng)基同步生長24 h后，按照分組:(1)正常對照組，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng);(2)UⅡ組，加入U(xiǎn)Ⅱ，終濃度為10-8mol·L-1;(3)氟伐他汀組:UⅡ組培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上加入氟伐他汀，終濃度為10-7mmol·L-1氟伐他汀;(4)urantide組:UⅡ組培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上加入urantide，終濃度為10-10～10-6mol·L-1，于48 h收集培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測上清中MCP-1的含量。每組設(shè)5個復(fù)孔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 飼高脂飼料大鼠胸主動脈的組織結(jié)構(gòu)改變

HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對照組大鼠血管內(nèi)皮完整，中膜可見梭形平滑肌細(xì)胞，彈力纖維層結(jié)構(gòu)清晰完整(圖1A);而飼高脂飼料大鼠病變部位內(nèi)膜明顯增厚，血管內(nèi)皮細(xì)胞排列不完整，平滑肌細(xì)胞在內(nèi)膜增生顯著，大量堆積的泡沫細(xì)胞，出現(xiàn)典型AS病理改變(圖1B)。說明ip給予Vit D3聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)的方法可成功建立大鼠AS模型。

圖1 飼高脂飼料大鼠胸主動脈的組織結(jié)構(gòu)(HE×200).Wistar大鼠飼以高脂飼料基礎(chǔ)上，每天ip給予維生素D370 U·kg-1，連續(xù)3 d。實(shí)驗(yàn)周期為6周.A:正常對照組;B:飼高脂飼料組.Fig.1 Morphological characters of thoracic aorta of atherosclerosis(AS)rats fed with high fat diet(HE×200)

2.2 urantide對動脈粥樣硬化大鼠體質(zhì)量的影響

表1結(jié)果顯示，在模型制備期間，正常對照組大鼠體質(zhì)量隨飼養(yǎng)時間的增加而增長;與正常對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯減少(P＜0.01)。給藥后，與模型組比較，只有urantide給藥14 d時的體質(zhì)量顯著增加，與氟伐他汀組近似(P＜0.05)。urantide給藥3 d與7 d體質(zhì)量與模型組無差異，依舊低于正常對照組(P＜0.01)。

表1 urantide對動脈粥樣硬化(AS)大鼠體質(zhì)量的影響Tab.1 Effect of urantide on body mass of atherosclerosis(AS)rats

2.3 urantide對動脈粥樣硬化大鼠血脂和血鈣濃度的影響

表2結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清中Ca2+，TG，TC，HDL及LDL含量均明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，氟伐他汀組血清中Ca2+，TG，TC，HDL及LDL含量均明顯降低(P＜0.01)，urantide各給藥組在給藥后，血清中各項(xiàng)指標(biāo)均隨給藥時間的延長呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(P＜0.01)，達(dá)到或接近氟伐他汀組的水平。

2.4 urantide對動脈粥樣硬化大鼠胸主動脈MCP-1表達(dá)的影響

圖2和表3結(jié)果顯示，正常對照組大鼠胸主動脈內(nèi)膜及中膜幾乎沒有MCP-1表達(dá)。在模型組胸主動脈AS斑塊內(nèi)，MCP-1陽性顆粒有少量表達(dá)。urantide各給藥組及氟伐他汀組MCP-1表達(dá)減少。

表2 urantide對AS大鼠血脂和血鈣濃度的影響Tab.2 Effect of urantide on lipid and calcium concentrations of AS rats

圖2 免疫組化法檢測urantide對AS大鼠胸主動脈單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)表達(dá)的影響(×400).A:正常對照;B:模型;C:氟伐他汀;D，E，F(xiàn):urantide給藥3，7及14 d組.Fig.2 Effect of urantide on monocyte chemotactic protein-1(MCP-1)in thoracic aorta of AS rats by immunohistochemistry(×400).

表3 urantide對AS大鼠MCP-1表達(dá)的影響Tab.3 Effect of urantide on MCP-1 expression in AS rats

2.5 urantide對血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中MCP-1含量的影響

表4結(jié)果顯示，與正常對照組比較，UⅡ組VSMC培養(yǎng)上清中MCP-1的表達(dá)明顯增加(P＜0.01);urantide各濃度組對MCP-1的表達(dá)均有下調(diào)趨勢，僅urantide 10-8，10-7及10-6mol·L-1組對MCP-1的抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。

表4 urantide對尾加壓素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中MCP-1表達(dá)的影響Tab.4 Effect of urantide on MCP-1 expression in vascular smooth muscle cells induced by urotensinⅡ

3 討論

研究證實(shí)，MCP-1主要存在于AS損傷部位脂質(zhì)核心周緣富含巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和VSMC的區(qū)域。AS早期，炎癥細(xì)胞在內(nèi)膜聚集的過程，依賴于炎癥細(xì)胞相關(guān)趨化因子的表達(dá)［5-6］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在模型組的胸主動脈內(nèi)膜及中膜斑塊內(nèi)有MCP-1陽性顆粒表達(dá)，得到與MCP-1在血管損傷早期表達(dá)相一致的類似結(jié)果，提示MCP-1直接或間接地參與AS的發(fā)生。MCP-1在單獨(dú)或與其他細(xì)胞因子協(xié)同作用下，可吸引血中單核細(xì)胞浸潤到動脈壁，而浸潤的單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮轉(zhuǎn)變成巨噬細(xì)胞，后者表面的受體與氧化變性的LDL結(jié)合，使之?dāng)z入大量的膽固醇，成為AS的泡沫細(xì)胞，促進(jìn)AS斑塊形成［7］。動物實(shí)驗(yàn)中，正常對照組MCP-1陽性顆粒在胸主動脈內(nèi)膜及中膜幾乎沒有表達(dá);在胸主動脈內(nèi)膜及中膜斑塊內(nèi)，模型組MCP-1陽性顆粒有少量表達(dá);而urantide給藥3，7及14 d時，MCP-1陽性顆粒表達(dá)較模型組染色強(qiáng)度和范圍逐漸減少。由此表明，urantide對MCP-1的表達(dá)有下調(diào)趨勢，MCP-1隨AS癥狀緩解而表達(dá)減少，這可能與UⅡ在AS含量變化有關(guān)。

MCP-1除能趨化單核細(xì)胞和T細(xì)胞外，對VSMC也有趨化、增殖作用，對單核/巨噬細(xì)胞的遷移和激活起特異性調(diào)控作用，從而直接或間接地參與AS的發(fā)生和發(fā)展［8］。UⅡ?qū)SMC有很強(qiáng)的促絲裂作用，并與其他絲裂原有協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在VSMC的培養(yǎng)上清中，UⅡ?qū)CP-1的表達(dá)有上調(diào)作用，UⅡ受體拮抗劑urantide各濃度組對MCP-1的表達(dá)均有下調(diào)趨勢，表明urantide不但可以拮抗UⅡ?qū)SMC的促絲裂作用，而且還可進(jìn)一步的抑制UⅡ和炎癥因子MCP-1之間的協(xié)同促增殖作用。

綜上所述，在AS中，UⅡ特異性受體拮抗劑urantide在競爭性拮抗UⅡ?qū)Υ笫笮刂鲃用}收縮及促絲裂作用的同時，對炎癥因子MCP-1的表達(dá)也有下調(diào)作用，使大鼠AS癥狀緩解，對AS起一定的保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能是urantide直接拮抗UⅡ與其受體GPR14結(jié)合產(chǎn)生的，也可能是通過調(diào)節(jié)MCP-1等炎癥因子的表達(dá)間接引起的，或者是由其他途徑介導(dǎo)的，這些尚有待進(jìn)一步研究。

［1］Ban Y，Watanabe T，Suguro T，Matsuyama TA，Iso Y，Sakai T，et al.Increased plasma urotensin-Ⅱand carotid atherosclerosis are associated with vascular dementia［J］.J Atheroscler Thromb，2009，16(3):179-187.

［2］Cheriyan J，Burton TJ，Bradley TJ，Wallace SM，M?kiúPet?j? KM，Mackenzie IS，et al.The effects of urotensinⅡand urantide on forearm blood flow and systemic haemodynamics in humans［J］.Br J Clin Pharmacol，2009，68(4):518-523.

［3］林楊，葉山東.單核細(xì)胞趨化蛋白-1與糖尿病動脈粥樣硬化的關(guān)系［J］.國際內(nèi)科學(xué)雜志，2007，34(7):381-385.

［4］Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the 1990s［J］.Nature，1993，362(6423):801-809.

［5］Weisberg SP，Hunter D，Huber R，Lemieux J，Slaymaker S，Vaddi K，et al.CCR2 modulates inflammatory and metabolic effects of high-fat feeding［J］.J Clin Invest，2006，116(1):115-124.

［6］Viedt C，Vogel J，Athanasiou T，Shen W，Orth SR，Kübler W，et al.Monocyte chemoattractant protein-1 induces proliferation and interleukin-6 production in human smooth muscle cells by differential activation of nuclear factor-kappaB and activator protein-1［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002，22(6):914-920.

［7］陳志偉，李勝濤，陳琪，張靜，張鈺敏.白細(xì)胞介素26、白細(xì)胞介素210與冠心病關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6(8):949-951.

［8］Ohman MK，Eitzman DT.Targeting MCP-1 to reduce vascular complications of obesity［J］.Recent Pat Cardiovasc Drug Discov，2009，4(3):164-176.

Inhibitory effect of urantide on monocyte chemotactic protein-1 in atherosclerotic rats

ZHAO Juan
(Department of Pathophysiology，Chengde Medical College，Chengde067000，China)

OBJECTIVETo study the effect of urantide on monocyte chemotactic protein-1(MCP-1)expression in the vascular smooth muscle cells(VSMC)of the thoracic aorta atherosclerotic(AS)rats.METHODSThe AS rat model was replicated by high fat diet with vitamin D3intraperitoneally.Urantide was injected from tail vein at 30 μg·kg-1·d-1，the body mass in various groups of rats were recorded and triglyceride(TG)，total cholesterol(TC)，high density lipoprotein(HDL)，low density lipoprotein(LDL)and the concentration of calcium in serum were detected at 3，7 and 14 d after urantide injection.The MCP-1 protein expression was detected by immunohistochemistry.The VSMC of thoracic aorta were cultured in vivo in the medium containing urotensinⅡ(10 μmol·L-1)with or without urantide 0.1，1，10，100 and 1000 nmol·L-1.The MCP-1 in the medium was detected by ELISA after 48 h.RESULTSCompared with AS model group，only the body mass of 14 d group of urantide 30 μg·kg-1increased significantly(P＜0.05)while Ca2+，TG，TC，HDL and LDL in 3，7 and 14 d all decreased markedly(P＜0.01).The immunostaining of MCP-1 could be seen in the intima and media of thoracic aorta，which increased significantly as well.Urantide down-regulated the expression of MCP-1 in VSMC(P＜0.01).CONCLUSIONMCP-1 can be inhibited by urantide in AS rats.

urantide;urotensinⅡ;monocyte chemotactic protein-1;atherosclerosis;vascular smooth muscle cells

The project supported by Major Projects Funded Project of Science and Technology Bureau of Jilin Province(2005040425);and by Doctor Funded Project of Chengde Medical College(201102)

ZHAO Juan，E-mail:zhaojuan811015@sina.com，Tel:(0314)2291364

R966，R363

A

1000-3002(2011)05-0425-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2011.05.003

吉林省科技廳重大項(xiàng)目資助課題(2005040425);承德醫(yī)學(xué)院博士基金(201102)

趙娟(1981-)，女，博士，主要從事病理學(xué)研究。

趙娟，E-mail:zhaojuan811015@sina.com，Tel:(0314)2291364

2011-03-01接受日期:2011-07-05)

(本文編輯:喬虹)