PDMS微孔陣列細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的初步構(gòu)建與評(píng)測(cè)

何懿 欒杰

PDMS微孔陣列細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的初步構(gòu)建與評(píng)測(cè)

何懿 欒杰

目的 應(yīng)用聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）為微孔支架材料制備微陣列細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)平臺(tái)，對(duì)大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSCs)在不同孔徑微陣列中的貼附能力進(jìn)行研究。方法 采用PDMS為微孔支架材料，制備20 μm、40 μm、60 μm和80 μm不同孔徑微陣列，將大鼠ADSC單細(xì)胞接種其上，分別對(duì)各組中細(xì)胞的貼附能力及形態(tài)進(jìn)行觀察及檢測(cè)。結(jié)果 硅晶圓模板經(jīng)酸性雙氧水清洗倒模后形成的PDMS微陣列支架基本符合設(shè)計(jì)要求；ADSCs直接種植在未經(jīng)預(yù)處理的支架上時(shí)，細(xì)胞貼附能力明顯下降；而經(jīng)10%胎牛血清（FBS）培養(yǎng)基完全浸泡預(yù)處理后，細(xì)胞在PDMS表面的貼附及存活能力提高；體外培養(yǎng)120 h時(shí)，不同孔徑的微孔內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)總數(shù)具有顯著性差異。結(jié)論 在PDMS材料上可以制作適合于大鼠ADSCs生長(zhǎng)的不同直徑的微孔陣列。

微孔陣列 微尺度技術(shù) 聚二甲基硅氧烷

組織工程技術(shù)發(fā)展迅速，但是目前還存在著許多需要解決的問題，如細(xì)胞純化、種子細(xì)胞體外培養(yǎng)后生物學(xué)性狀改變、天然或人工支架材料三維結(jié)構(gòu)難以精細(xì)控制以及支架內(nèi)種子細(xì)胞生物學(xué)特性檢測(cè)手段不力等問題，這些問題限制了組織工程研究的進(jìn)一步發(fā)展及臨床應(yīng)用的推廣。

微尺度技術(shù)（Microscale technologies）為解決上述問題提供了新的思路。該技術(shù)是在1 μm～1 mm尺度范圍內(nèi)進(jìn)行工程設(shè)計(jì)、制備和分析的新技術(shù)[1]。利用微尺度技術(shù)加工的微孔陣列（Micro-well arrays）可以在不同材料（玻璃、硅、PDMS、PLGA等）表面生成大量（每平方厘米內(nèi)有數(shù)百至數(shù)千個(gè)）微孔，微孔的形態(tài)、排列及密度可根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容而異。將微孔陣列應(yīng)用于組織工程及細(xì)胞生物學(xué)研究，將具有前所未有的潛力，是解決諸多難題的潛在的有力工具[2]。更為重要的是，微孔陣列不僅能滿足高通量檢驗(yàn)的需求，尤其適用于數(shù)量少、來(lái)源寶貴的干細(xì)胞研究[3]。

本實(shí)驗(yàn)利用微陣列技術(shù)，采用聚二甲基硅氧烷（Polydimethyl-siloxane，PDMS）為微孔支架材料，對(duì)大鼠脂肪干細(xì)胞（ADSCs）在不同孔徑微陣列中的貼附能力進(jìn)行研究，以期驗(yàn)證微孔陣列這一新興實(shí)驗(yàn)平臺(tái)在干細(xì)胞研究中的可行性，同時(shí)初步明確細(xì)胞在微孔陣列三維培養(yǎng)平臺(tái)上的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)，為干細(xì)胞組織工程的深入研究打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料

光刻機(jī)：德國(guó)Karl Suss公司MA6/BA6型，波長(zhǎng)為紫外光（i線）356 nm；臺(tái)階儀：KLA-Tencor P-6；電感應(yīng)耦合等離子體（Inductively Coupled Plasma，ICP）；刻蝕機(jī)：Alcatel 601E-D 型；刻蝕氣體：C4F8和SF6。 聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）：Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit（Dow Corning，USA）。

1.2 光刻掩膜加工及光刻流程

1.2.1 掩膜設(shè)計(jì)及加工

依照?qǐng)D1樣式設(shè)計(jì)硅晶圓加工前的掩膜。所設(shè)計(jì)圖形每片面積1 cm2，內(nèi)有約6 800～6 900個(gè)微孔。

采用步進(jìn)機(jī)（Stepper）刻畫，激光束直接在涂有鉻層的5''玻璃板上刻畫，邊緣起點(diǎn)5 mm。用步進(jìn)機(jī)重復(fù)將掩膜原版（Reticle mask）比例縮小到master mask上，應(yīng)用到實(shí)際曝光中的為工作掩膜（Working mask），工作掩膜由master mask復(fù)制而來(lái)。

圖1 微孔陣列光刻掩膜設(shè)計(jì)Fig.1 The photolithography mask design of microwell arrays

1.2.2 光刻流程

硅晶圓表面經(jīng)清潔、干燥后，均勻涂布光刻膠并加熱使其部分蒸發(fā)。上光刻機(jī)后將掩膜板和圖形在涂布光刻膠的硅晶圓上精準(zhǔn)對(duì)焦后曝光。利用有機(jī)溶劑去除非聚合光刻膠，加熱，繼續(xù)蒸發(fā)溶劑。經(jīng)檢查表面對(duì)準(zhǔn)良好、無(wú)明確缺陷后，將晶圓頂層沒有光刻膠保護(hù)的開放部位刻蝕去除，刻蝕深度控制在20～30 μm范圍。隨后溶解光刻膠，檢查晶圓表面結(jié)構(gòu)規(guī)整程度及是否存在加工缺陷。清洗，烘干，裝盒備用（圖2）。

1.3 PDMS模板的生成與加工

1.3.1 硅晶圓的清洗

采用雙氧水體系清洗，除去原子、離子等不可見污染。將經(jīng)過光刻、帶有陣列結(jié)構(gòu)的硅晶圓完全浸沒于成分比為 H2SO4（98%）∶H2O2（10%）=5∶1（或 4∶1）的酸性液中清洗，將硅晶圓表面的有機(jī)物分解去除。隨后，用超純水沖洗后，再用成分比為 H2O∶H2O2∶NH4OH為 5∶2∶1（或 5∶1∶1，或 7∶2∶1）的堿性清洗液清洗，使金屬離子形成可溶性絡(luò)合物而溶于水。然后，使用成分比為 H2O∶H2O2∶HCL=7∶2∶1（或 5∶2∶1）的酸性清洗液，使金屬微粒生成溶于水的絡(luò)合離子，從而達(dá)到清洗目的。

1.3.2 硅晶圓表面處理

在澆注PDMS前用氟硅烷試劑對(duì)模板表面熏蒸120 min，也可將經(jīng)過超聲清洗后的硅晶圓浸泡于含有5%油污洗滌劑的去離子水溶液中，使微孔板表面黏附上一層稀薄的洗滌劑成分薄膜。隨后圖形面向上放置于烘箱內(nèi)80℃烘干，經(jīng)PDMS澆筑后，發(fā)現(xiàn)可以有效減少脫模張力，保護(hù)硅晶圓表面結(jié)構(gòu)。

1.3.3 PDMS微孔板的形成

本實(shí)驗(yàn)選用硅橡膠預(yù)聚物Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit(Dow Corning，USA)，由液體 A、B 兩組分組成，可按10∶1重量比混合為中等黏度的混合液，具體實(shí)驗(yàn)流程如下：①取彈性模板材料PDMS前驅(qū)物A組分（基本組分）10 g至玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)。②按質(zhì)量比10∶1加入B組分（固化劑）1 g充分混合均勻，放入真空干燥罐中負(fù)壓抽吸30 min，去除因攪拌產(chǎn)生的氣泡。③將混合好的PDMS混合液傾倒于硅晶圓表面，水平放置于真空條件下保持負(fù)壓抽吸1 h，去除殘留的氣泡。隨后水平置入鼓風(fēng)干燥箱80℃烘烤2 h，固化后剝離得到表面復(fù)制精細(xì)圖形的彈性模板。④將圖形轉(zhuǎn)移后的PDMS板用手術(shù)刀沿微孔區(qū)域間的分割線切割，將切割好的微孔板圖形面朝下置于盛有95%乙醇的大燒杯中，后置于水平搖床上以100 r/min的速度晃動(dòng)清洗，之后用去離子水將殘留的乙醇沖洗干凈，將微孔板表面朝下水平浸入盛有去離子水的超聲清洗儀液面下，超聲清洗8 min，共3次；然后，依據(jù)微孔不同孔徑分裝于玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)。⑤消毒采用乙醇浸泡法或高溫高壓消毒法。

如采用乙醇浸泡法，可直接將清洗好的微孔板依照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分裝于塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，使75%乙醇完全浸泡微孔板，根據(jù)揮發(fā)量每24 h補(bǔ)充一次乙醇。實(shí)驗(yàn)前24 h停止添加乙醇，打開培養(yǎng)皿，置于通風(fēng)櫥或生物安全柜中，紫外光照射，待其自然揮發(fā)干燥后封口備用。

如采用高溫高壓消毒法，可將切割為1 cm2的小塊分裝于不同玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)。將分裝好的PDMS微孔板進(jìn)行高溫高壓消毒。消毒后再于生物安全柜中將微孔板分裝于滅菌塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，待其干燥后封口備用。

1.3.4 PDMS微孔板掃描電鏡計(jì)量

倒模后形成的PDMS微孔板經(jīng)噴金后行掃描電鏡觀察，分別測(cè)量 20 μm、40 μm、60 μm 和 80 μm孔的直徑，以20 μm口徑微孔板為例，誤差率小于5%（圖3），滿足實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要。

圖3 20 μm微孔精度測(cè)量（掃描電鏡，1 000×）Fig.3 The measurement of 20 μm pore precision(SEM,1 000×)

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于大鼠ADSCs而言，20 μm孔徑過小，細(xì)胞很難進(jìn)入，故將其翻轉(zhuǎn)180°，取其背面平坦表面為空白對(duì)照。

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，接種細(xì)胞濃度在5×105cells/L時(shí)，可使一個(gè)細(xì)胞占據(jù)單個(gè)微孔的比例最高。

1.4.1 分組一

為檢驗(yàn)PDMS的生物安全性，設(shè)計(jì)將純平面空白板共20塊浸泡于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，根據(jù)浸泡時(shí)間設(shè)計(jì)A、B、C、D、E和F共6組，每組 4板，分別為未浸泡組及浸泡 24 h、48 h、72 h、96 h和120 h組。

1.4.2 分組二

將消毒的PDMS微孔板在生物安全柜內(nèi)分裝于培養(yǎng)皿內(nèi)，每一皿中分別包含空白板、40 μm、60 μm和80 μm各1片，共6皿。分裝后將微孔板浸泡于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中72 h（圖4）。

圖4 4種PDMS微孔板用含10%FBS的DMEM浸泡Fig.4 Four kinds of PDMS micro-well plates immersed in 10%FBS DMEM medium

1.5 大鼠ADSCs的分離與培養(yǎng)

于無(wú)菌條件下切取400 g左右成年雄性SD大鼠腹股溝區(qū)脂肪墊，用組織剪剪碎后放入0.12%Ⅰ型膠原酶溶液中，于37℃下水平搖床（120 r/min）震蕩1 h，然后加入等量的10%胎牛血清、1%青鏈霉素及DMEM培養(yǎng)基以中和膠原酶。消化后的細(xì)胞懸液離心后重懸至上述培養(yǎng)基中，并經(jīng)100 μm細(xì)胞篩過濾，過濾后的細(xì)胞懸液接種在100 mm2培養(yǎng)皿中，24～48 h后換液，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化后與不含抗生素的10%FBS培養(yǎng)基混勻接種于六孔板中待轉(zhuǎn)染。取一部分原代培養(yǎng)的細(xì)胞接種于六孔板中，用于成骨及成脂誘導(dǎo)鑒定。

1.5.1 ADSCs的成脂誘導(dǎo)及成脂分化鑒定

ADSCs經(jīng)胰酶消化后以1×105個(gè)/孔的密度接種到六孔板中，細(xì)胞貼壁后換用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（1 μM dexamethasone，0.5 mM IBMX，200 μM indomethacin，10 μM Insulin）隔日換液至誘導(dǎo)后 10 d。

細(xì)胞爬片以含鈣福爾馬林固定15 min，水洗后60%異丙醇孵育2 min，油紅O染色30 min，70%乙醇分色1～2 min，鏡下控制染色時(shí)間。

1.5.2 ADSCs的成骨誘導(dǎo)及成骨分化鑒定

ADSCs經(jīng)胰酶消化后以1×105個(gè)/孔的密度接種到六孔板中，細(xì)胞貼壁后換用骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（50 μM ascorbate-2-phosphate，10 mM β-磷酸甘油及 0.01 μM 1,25-dihydroxyvitamin）。另一組細(xì)胞換用正常培養(yǎng)基作為對(duì)照，成骨誘導(dǎo)持續(xù)4周。

1.5.2.1 茜素紅染色

細(xì)胞爬片以95%乙醇固定10 min，水洗后放入0.1%茜素紅染料中37℃孵育30 min。

1.5.2.2 堿性磷酸酶染色

細(xì)胞爬片以檸檬酸丙酮緩沖液固定30 sec，并使用 Naphthol/Fast blue染料 （Sigma-Aldrich Kit 85L2-1KT，USA）染色 30 min，蘇木素復(fù)染 3 min。

1.5.2.3 骨鈣素免疫組化染色

細(xì)胞爬片10 mM（pH 6.0）檸檬酸鈉緩沖液中熱修復(fù)20 min，5 μg/mL羊抗鼠骨鈣素一抗和Avidin-HRP Kit（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色。

1.6 大鼠ADSCs的種植

1.6.1 分組一

在24塊空白板表面種植5×105cells/L濃度的大鼠ADSCs，滴懸液100 μL，以略少于微孔板數(shù)量的密度進(jìn)行種植。在高倍鏡（40×）下對(duì)50個(gè)獨(dú)立視野進(jìn)行拍照，計(jì)量種植后 4 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h等不同時(shí)間點(diǎn)板載細(xì)胞數(shù)，取所得細(xì)胞數(shù)量平均值繪圖。戊二醛固定，掃描電鏡觀察。

1.6.2 分組二

4種不同微孔板表面種植大鼠ADSCs，以濃度5×105cells/L的滴懸液100 μL種植于微孔板表面，并以相同濃度細(xì)胞懸液400 μL在普通培養(yǎng)皿內(nèi)種植。 于種植后 1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d 和 7 d 在高倍鏡下對(duì)50個(gè)獨(dú)立視野拍照，計(jì)量普通培養(yǎng)皿表面、空白組表面和不同孔徑微孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量變化，取細(xì)胞數(shù)量平均值繪圖。戊二醛固定，掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 大鼠ADSCs培養(yǎng)

細(xì)胞于誘導(dǎo)開始后即停止分裂增殖，由長(zhǎng)梭形變成不規(guī)則的圓形，體積增大，大小不一。最早于誘導(dǎo)后4 d即可在細(xì)胞內(nèi)看到小脂滴，脂滴逐漸增多，有的融合形成較大的脂滴。誘導(dǎo)14 d時(shí)細(xì)胞分化達(dá)到高峰，經(jīng)油紅O染色證實(shí)為脂滴（圖5）。

圖5 大鼠ADSCs成脂誘導(dǎo)10 d（油紅O染色，光鏡，40×）Fig.5 Rat ADSCs adipogenic for 10 days(Oil red O staining,40×)

圖6 大鼠ADSCs成骨誘導(dǎo)4周（茜素紅染色，光鏡，40×）Fig.6 Rat ADSCs osteogenic for 4 weeks(Alizarin red staining,40×)

體外傳2代后，換骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞由長(zhǎng)梭型成纖維細(xì)胞樣逐漸變?yōu)閳A形及多角形，細(xì)胞間相互聚集成結(jié)節(jié)狀，誘導(dǎo)4周后有大團(tuán)骨結(jié)節(jié)形成。骨結(jié)節(jié)的結(jié)構(gòu)在茜素紅染色中顯示較強(qiáng)的紅色（圖6）；堿性磷酸酶染色顯示，經(jīng)誘導(dǎo)的ADSCs尤其是骨結(jié)節(jié)形成區(qū)域附近，有明顯的堿性磷酸酶活性升高表現(xiàn)（圖7）。骨鈣素免疫組織化學(xué)染色顯示，經(jīng)誘導(dǎo)的ADSCs呈陽(yáng)性表現(xiàn)，尤以細(xì)胞核和骨結(jié)節(jié)區(qū)域更明顯（圖8）。未誘導(dǎo)組均未發(fā)現(xiàn)上述陽(yáng)性結(jié)果。

圖7 大鼠ADSCs成骨誘導(dǎo)4周（堿性磷酸酶染色，光鏡，200×）Fig.7 Rat ADSCs osteogenic for 4 weeks(Alkaline phosphatase staining,200×)

圖8 大鼠ADSCs成骨誘導(dǎo)4周（骨鈣素免疫組化染色，光鏡，40×）Fig.8 Rat ADSCs osteogenic for 4 weeks(Immunohistochemical staining of osteocalcin,40×)

本研究利用原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從大鼠脂肪組織中分離出ADSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，可以進(jìn)行成脂、成骨分化，具有多向分化潛能。經(jīng)初步鑒定，證實(shí)其為ADSCs。

2.2 實(shí)驗(yàn)一部分

未經(jīng)培養(yǎng)液預(yù)處理的PDMS空白板，種植細(xì)胞后細(xì)胞存活天數(shù)明顯少于正常培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞。PDMS空白板浸泡于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)的時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞存活數(shù)量越多（圖9）。細(xì)胞于浸泡達(dá)72 h的空白板表面穩(wěn)定生長(zhǎng)，數(shù)量增殖不明顯。同時(shí)，繼續(xù)延長(zhǎng)浸泡時(shí)間對(duì)于細(xì)胞數(shù)量的增加并無(wú)明顯作用（圖10）。

圖9 含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基浸泡時(shí)間不同對(duì)PDMS板載細(xì)胞數(shù)量的影響Fig.9 The cell numbers of PDMS plates that immersed in DMEM medium containing 10%FBS for different times

圖10 含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基浸泡72 h不同平面細(xì)胞存活數(shù)量的比較Fig.10 The cell numbers of different kinds of PDMS plates immersed in DMEM medium containing 10%FBS for 72 h

掃描電鏡觀察，對(duì)照組細(xì)胞體積差異較大，形態(tài)不均一。細(xì)胞呈梭形、多角形爬附于PDMS表面。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，鄰近細(xì)胞間接觸增多，可見細(xì)胞間的交叉、堆疊（圖11）。

2.3 實(shí)驗(yàn)二部分

根據(jù)細(xì)胞數(shù)量繪制生長(zhǎng)曲線，普通培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細(xì)胞可見平臺(tái)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞增殖曲線呈“S”型。

PDMS空白組并未出現(xiàn)普通培養(yǎng)皿的增殖曲線，且其數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而少量增加。細(xì)胞形態(tài)改變同實(shí)驗(yàn)一。

不同微孔板間，僅40 μm孔徑組細(xì)胞數(shù)量較其他各組有所增加。同60 μm組和80 μm組相比，40 μm組細(xì)胞增殖更明顯（P＜0.05）。因受微孔空間限制，細(xì)胞不會(huì)鋪滿生長(zhǎng)區(qū)域，ADSCs在具有微孔結(jié)構(gòu)的PDMS板上會(huì)依據(jù)微孔形態(tài)、大小貼附后生長(zhǎng)，并在微孔內(nèi)伸出偽足狀結(jié)構(gòu)（圖12），細(xì)胞所能延展的大小完全受微孔尺寸限制。

圖11 大鼠ADSCs在PDMS表面培養(yǎng)72 h（掃描電鏡，1 000×）Fig.11 ADSCs cultured on PDMS surface for 72 h(SEM,1 000×)

圖12 大鼠ADSCs在PDMS表面培養(yǎng)96 h（掃描電鏡，1 000×）Fig.12 ADSCs cultured on PDMS surface for 96 h(SEM,1 000×)

3 討論

3.1 微孔陣列技術(shù)

3.1.1 微孔陣列技術(shù)應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域的必要性三維空間物理因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育存在影響已經(jīng)越來(lái)越被學(xué)者所認(rèn)同。傳統(tǒng)組織工程技術(shù)通常先在平面培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)擴(kuò)增種子細(xì)胞，再將細(xì)胞接種于支架植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)以觀察支架細(xì)胞復(fù)合體的治療效果。這種方法存在很多無(wú)法克服的缺點(diǎn)：①經(jīng)分離培養(yǎng)后的細(xì)胞，仍不能做到完全的純化，接種于支架內(nèi)的細(xì)胞常常是混雜的多種細(xì)胞，某些獨(dú)立細(xì)胞系的真實(shí)狀態(tài)被這種混雜狀態(tài)所掩蓋；②種子細(xì)胞在體外普通平面培養(yǎng)過程中其生長(zhǎng)環(huán)境較體內(nèi)發(fā)生了巨大改變，其相應(yīng)的生物學(xué)性狀也極有可能發(fā)生了改變，對(duì)于其接種并植入體內(nèi)后的生物學(xué)行為造成的影響無(wú)法估量；③現(xiàn)有的支架材料，無(wú)論是天然的還是人工的，其內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)大多復(fù)雜、不規(guī)整，其立體三維結(jié)構(gòu)很難嚴(yán)格控制，對(duì)種子細(xì)胞的生物學(xué)行為也存在無(wú)法預(yù)測(cè)的影響；④細(xì)胞接種支架后，其生物學(xué)行為大部分只能應(yīng)用組織切片方法才能觀察。而組織切片過程可能造成支架、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞或移位，無(wú)法實(shí)現(xiàn)100%的真實(shí)還原。以上缺點(diǎn)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)者無(wú)法確定是什么樣的細(xì)胞生長(zhǎng)于什么樣的空間環(huán)境中，而細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)如何也不得而知，使得組織工程的研究應(yīng)用缺乏嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

微尺度技術(shù)是在1 μm～1 mm尺度范圍內(nèi)進(jìn)行工程設(shè)計(jì)、制備和分析的新技術(shù)。利用微尺度技術(shù)加工的微孔陣列可以在不同材料（玻璃、硅、PDMS、PLGA等）表面生成大量（每平方厘米內(nèi)有數(shù)百至數(shù)千個(gè)）微孔。將微孔陣列應(yīng)用于組織工程及細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域，是解決這一領(lǐng)域諸多難題的潛在有力工具[2]，隨著軟印模技術(shù)和光刻技術(shù)的不斷發(fā)展，使得微孔陣列也越來(lái)越多地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的研究中。

本實(shí)驗(yàn)中，為保證單位面積（1 cm2）內(nèi)微孔數(shù)量恒定，將各孔的水平排列設(shè)計(jì)為斜60°，將此陣列各微孔中心點(diǎn)間距固定為120 μm，即各孔間排列為正三角形（圖13），孔間距在各方向上保持基本相等。

圖13 不同孔徑PDMS微孔透光性觀察（光鏡，100×）Fig.13 The translucent observation of different size of PDMS micro-well plates(optical microscopy,100×)

3.2 PDMS生物安全性

PDMS是一種透明（透光率可達(dá)100%，圖11）、安全無(wú)毒、生物相容性好的彈性材料，廣泛應(yīng)用于絕緣、潤(rùn)滑、防水、防震和防油塵領(lǐng)域，可直接應(yīng)用于組織工程支架的構(gòu)建[3]。PDMS具有生理惰性、良好的化學(xué)穩(wěn)定性、電絕緣性，其耐熱性、耐寒性好，黏度隨溫度變化小。其表面張力小，并具有很高的抗剪切能力，可在-50～200℃下長(zhǎng)期使用。以PDMS為材質(zhì)的微孔陣列具備良好的物理化學(xué)屬性[3]。

3.3 硅晶圓清洗及預(yù)處理

3.3.1 硅晶圓清洗

采用雙氧水體系清洗效果好，環(huán)境污染小，可將硅晶圓表面的有機(jī)物、金屬離子、微粒徹底清除。圖14為未經(jīng)清洗倒模的PDMS板（A）和經(jīng)過清洗后倒模的PDMS板（B），若不清洗會(huì)造成倒模生成的PDMS表面殘留過多的雜質(zhì)微粒，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖14 硅模板清洗前后倒模生成PDMS微孔板對(duì)比（光鏡，40×）Fig.14 The comparison of PDMS micro-well plates generated from silicon master before(A)and after(B)cleaning (optical microscopy,40×)

3.3.2 硅晶圓表面預(yù)處理

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)表面脫模不良可以導(dǎo)致PDMS板撕裂、硅模板微柱斷裂，尤其是PDMS用量較大、微孔板較厚、固化劑添加比例偏多時(shí)更為嚴(yán)重（圖15），硅晶圓表面的微柱結(jié)構(gòu)可因脫模時(shí)的成角剪切力而斷裂。故此，添加脫模劑或進(jìn)行表面硅烷化處理對(duì)于保護(hù)硅模板和新形成的PDMS微孔板同樣重要。

圖15 微孔結(jié)構(gòu)破壞Fig.15 The destruction of microporous structure

我們將經(jīng)過超聲清洗后的硅晶圓浸泡于含有5%油污洗滌劑的去離子水溶液中，使微孔板表面黏附上一層稀薄的洗滌劑成分薄膜。隨后圖形面向上放置于烘箱內(nèi)80℃烘干，經(jīng)PDMS澆筑后發(fā)現(xiàn)此法也可有效減少脫模張力，保護(hù)硅晶圓表面結(jié)構(gòu)。

3.4 PDMS加工、清洗及預(yù)處理

3.4.1 PDMS微孔板加工注意事項(xiàng)

本實(shí)驗(yàn)選用的硅橡膠預(yù)聚物Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit（Dow Corning，USA），由液體 A、B組分組成的套件產(chǎn)品，包括基本組分與固化劑。無(wú)論厚薄，混合液將固化成為具有韌性的透明彈性體。此產(chǎn)品為A、B劑混合硅膠，按10∶1重量比混合為中等粘度的稠度混合液。

Sylgard 184的固化反應(yīng)起始于混合過程的開始，其適用期隨溫度增高而縮短（適用期的定義為基本組分與固化劑混合后，黏度增至原來(lái)的兩倍所需的時(shí)間）。起初的固化現(xiàn)象是黏度逐步增加，接著開始出現(xiàn)凝膠，然后轉(zhuǎn)變?yōu)閺椥怨腆w。溫度會(huì)對(duì)固化時(shí)間產(chǎn)生明顯影響（材料用量大者需要適當(dāng)延長(zhǎng)固化時(shí)間），室溫下固化時(shí)間大于48 h，100℃約需35 min，125℃約需20 min，150℃約需10 min。

使用此材料時(shí)（未固化）前，不可接觸到胺類（如環(huán)氧樹脂），硫化物（如PU）及不飽和碳?xì)渌芰希ㄈ鏟VC），否則會(huì)抑制此材料的固化反應(yīng)，造成永久黏連、不固化。在預(yù)實(shí)驗(yàn)階段，配制PDMS混合液時(shí)曾使用PVC塑料棒攪拌，導(dǎo)致室溫下固化48 h不能完全固化，即使經(jīng)過100℃加熱固化仍存在拉絲、黏連等不凝固現(xiàn)象。這種不完全固化不僅會(huì)造成脫模困難，更為嚴(yán)重的是，可能在硅晶圓模板表面殘留不凝固PDMS成分，最終影響重復(fù)倒模的精確度。

3.4.2 PDMS板的清洗及再利用

光刻形成的硅晶圓模板表面經(jīng)過清洗后，澆筑脫氣泡的PDMS，經(jīng)熱固化后剝離可生成符合設(shè)計(jì)要求的微孔板，可以直接用于細(xì)胞培養(yǎng)（圖12）。利用這種方法加工所得的微孔陣列，精度高、表面質(zhì)量好，制作效率高，原材料的利用率接近100%[4]。

硅晶圓經(jīng)過清洗，表面雜質(zhì)、微粒已大大減少，但為保證實(shí)驗(yàn)精確、安全，推薦于實(shí)驗(yàn)分皿前用乙醇容積震蕩、超聲波等清洗方法徹底去除表面雜質(zhì)。

使用過的PDMS板，也可使用胰酶將表面殘留細(xì)胞、碎片清除，然后經(jīng)上述方法清洗、消毒后，微孔板還可以重復(fù)使用。

3.4.3 PDMS表面預(yù)處理

根據(jù)Charnley等[3]的研究報(bào)告，PDMS疏水性強(qiáng)，且對(duì)培養(yǎng)介質(zhì)內(nèi)的蛋白成分（如生長(zhǎng)因子）有較強(qiáng)的吸附作用，會(huì)影響正常細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。故在隨后的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中改進(jìn)支架處理工藝，將支架浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)一段時(shí)間，可明顯提高細(xì)胞在PDMS表面的存活時(shí)間。但是，對(duì)于爬附能力低或未貼壁的細(xì)胞，則有可能從PDMS表面脫落。此外，在培養(yǎng)過程中的搬運(yùn)、晃動(dòng)、換液沖刷等也可導(dǎo)致未貼附緊密的細(xì)胞從PDMS表面脫落。

有學(xué)者利用氧等離子處理PDMS和玻璃表面，再經(jīng)培養(yǎng)液浸泡過夜后其表面親水性在培養(yǎng)液浸泡前后存在明顯差異，經(jīng)培養(yǎng)液浸泡的兩種材料表面親水性都大大增加，蛋白質(zhì)的吸附為增加表面親水性的原因[5]。有一點(diǎn)需要特別指出，細(xì)胞在微孔陣列中的生長(zhǎng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不同于常規(guī)培養(yǎng)，主要原因是微孔結(jié)構(gòu)提供了與常規(guī)培養(yǎng)不同的生長(zhǎng)微環(huán)境[6]。細(xì)胞增殖到平臺(tái)期時(shí)并沒有鋪滿生長(zhǎng)區(qū)域，我們估計(jì)原因是隨著細(xì)胞數(shù)目增多，微孔內(nèi)培養(yǎng)溶液體積相對(duì)變小，使得營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不充分；并且較多的細(xì)胞代謝產(chǎn)物累積在周圍，形成了一個(gè)不利于細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。

3.5 PDMS表面及微孔內(nèi)細(xì)胞生物學(xué)表現(xiàn)

PDMS材料會(huì)吸附蛋白質(zhì)，若不進(jìn)行表面處理則無(wú)法直接用作細(xì)胞培養(yǎng)。經(jīng)過含血清培養(yǎng)基浸泡處理后的PDMS表面具備基本的細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)條件，基本滿足細(xì)胞培養(yǎng)的需要，可以作為細(xì)胞學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。PDMS表面細(xì)胞增殖數(shù)量低于普通培養(yǎng)皿表面，應(yīng)該同PDMS的蛋白吸附作用有關(guān)。

細(xì)胞在微孔陣列中的生長(zhǎng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不同于常規(guī)培養(yǎng)，主要原因是微孔結(jié)構(gòu)提供了與常規(guī)培養(yǎng)不同的生長(zhǎng)微環(huán)境[7]，微孔的立面結(jié)構(gòu)給細(xì)胞提供了很好的空間依附，在這樣的空間結(jié)構(gòu)幫助下，細(xì)胞有兩個(gè)面與材料表面接觸，能夠更穩(wěn)定地在PDMS表面生長(zhǎng)。

掉落于微孔內(nèi)的細(xì)胞并未出現(xiàn)大量增殖，可能與微孔結(jié)構(gòu)圍成的小環(huán)境有關(guān)。細(xì)胞貼附于PDMS表面后，必須保證自身在PDMS材料上的良好貼附才能有所生長(zhǎng)。若微孔結(jié)構(gòu)過大（60 μm、80 μm），就接近平面培養(yǎng)，雖可以與鄰近微孔立面接觸，但仍需要伸展到較大面積方可完成穩(wěn)定爬附。小一些的微孔結(jié)構(gòu)（40 μm），對(duì)于細(xì)胞而言，并不需要延展就可與多個(gè)立面接觸，故此爬附面積小，也就形成了填滿微孔的現(xiàn)象。因此我們認(rèn)為，當(dāng)微孔直徑與參與實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞大小相適宜時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)比較穩(wěn)定。

微孔內(nèi)的細(xì)胞較普通平面培養(yǎng)的細(xì)胞增殖減少。我們認(rèn)為這種空間結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)存在抑制作用。這種抑制應(yīng)屬于一種比較“溫柔”的抑制，更接近于細(xì)胞在體內(nèi)準(zhǔn)備階段的生活狀態(tài)。過度生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞并不能代表這種細(xì)胞的真實(shí)生理狀態(tài)。故此，40 μm孔徑的微孔內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)中有升，應(yīng)該與其內(nèi)部容積接近大鼠脂肪干細(xì)胞的平均體積有關(guān)。

4 結(jié)論

利用微加工技術(shù)可以在PDMS材料上制備適合于大鼠ADSCs生長(zhǎng)的不同直徑的微孔結(jié)構(gòu)。微孔陣列實(shí)驗(yàn)平臺(tái)可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同進(jìn)行精細(xì)調(diào)整，更精確地研究具體的科學(xué)問題。本實(shí)驗(yàn)中硅晶圓模板經(jīng)酸性雙氧水清洗、倒模后形成的PDMS微陣列，表面結(jié)構(gòu)精細(xì)，基本符合設(shè)計(jì)要求。

細(xì)胞直接種植在未經(jīng)預(yù)處理的支架上時(shí)細(xì)胞貼附能力明顯下降，而經(jīng)10%FBS培養(yǎng)基完全浸泡預(yù)處理后，細(xì)胞在PDMS表面的貼附及存活能力提高。

體外培養(yǎng)120 h時(shí)，其他條件保持恒定，不同孔徑（40 μm、60 μm、80 μm）的微孔內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)總數(shù)具有顯著性差異，40μm微孔較60μm和80μm微孔更適宜細(xì)胞生長(zhǎng)，證明不同孔徑微孔對(duì)大鼠ADSCs生長(zhǎng)存在影響。

光刻和軟印模技術(shù)的廣泛應(yīng)用、不斷成熟，使得微孔陣列技術(shù)成為組織工程學(xué)的有力工具。但利用微孔陣列平臺(tái)進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，仍須注意生物材料的選擇及表面處理方法等對(duì)細(xì)胞活性的影響。因此，在實(shí)驗(yàn)中必須仔細(xì)研究材料對(duì)細(xì)胞活動(dòng)的影響，才能根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)方法選擇適宜平臺(tái)制作的材料和操作方法，從而得到可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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The Initial Construction and Evaluation of PDMS Porous Array Platform for Cell Culture Experiments

HE Yi,LUAN Jie.Department of Plastic and Reconstructive Surgery of the Breast,Plastic Surgery Hospital of CAMS,Beijing 100144,China.

LUAN Jie(E-mail：doctorluan@hotmail.com).

ObjectiveTo establish a cell culture platform by using PDMS (Polydimethylsiloxane,PDMS)as porous scaffold materials and to test the attachment rate of rat adipose-derived stem cells(ADSCs)on different aperture microarray.MethodsThe micro-well arrays plates were designed by using PDMS (Polydimethylsiloxane,PDMS) porous scaffold materials at 20 μm,40 μm,60 μm and 80 μm pore sizes respectively.The single rat ADSC was inoculated on it.The morphology was observed and the attachment rate of cells were detached in each group.ResultsThe reverse mould pretreated PDMS microarray stent meets the requirements of the experiment after acid hydrogen peroxide washing;The cell attachment rate decreased significantly when the cells were planted directly on the stent without pretreatment while the cell attachment and survival rate increased significantly when the cells were planted on the stent pretreated by 10%FBS(Fetal bovine serum);There are significant differences of the total cell number between the different porous aperture at 120 h in vitro.ConclusionVarious diameter micro-well arrays could be produced on the surface of PDMS to facilitate the growth of rat ADSCs.

Micro-well arrays;Micro-scale technology;Polydimethylsiloxane

Q813.1+1

A

1673－0364（2011）03－0121－08

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.03.001

100144 北京市 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院乳房整形與再造中心。

欒杰（E-mail：doctorluan@hotmail.com）。

2011年5月8日；

2011年6月12日)