李震宇, 王愛娜, 劉曉節(jié),, 薛水玉,, 秦雪梅,, 郭小青, 張麗增 (山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心, 太原 030006;山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;通訊作者,Tel:035-700,E-mail:qinxm@sxu.edu.cn)
潞黨參極性和非極性成分HPLC指紋圖譜研究
李震宇1, 王愛娜1, 劉曉節(jié)1,2, 薛水玉1,2, 秦雪梅1,2*, 郭小青1, 張麗增1(1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心, 太原 030006;2山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;*通訊作者,Tel:0351-7011202,E-mail:qinxm@sxu.edu.cn)
目的 研究并建立潞黨參藥材極性和非極性成分HPLC指紋圖譜,為黨參質(zhì)量控制提供依據(jù)。 方法 采用HPLCUV法分別建立潞黨藥材中極性和非極性成分指紋圖譜,色譜條件為:Diamonsil C18色譜柱(200 mm×4.6 mm,5 μm);檢測波長分別為266 nm和230 nm;流動相:乙腈-水,分別進行梯度洗脫,對山西不同產(chǎn)地潞黨參藥材進行分析。 結(jié)果 潞黨參藥材非極性部分指紋圖譜有9個共有峰,極性部分指紋圖譜有13個共有峰,山西不同產(chǎn)地潞黨參極性和非極性指紋圖譜相似度較高(>0.87)。 結(jié)論 本文所建立的潞黨參藥材的HPLC指紋圖譜方法簡便、準確、重現(xiàn)性好,可作為黨參藥材質(zhì)量均一性評價的基礎(chǔ)。
潞黨參;HPLC; 指紋圖譜; 極性成分; 非極性成分
黨參為桔??浦参稂h參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf,素花黨參 C.Nannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen 或川黨參C.tangshenOliv.的干燥根,具有補中益氣、健脾益肺之功效[1],主產(chǎn)于山西、甘肅、陜西和四川等地。藥材商品根據(jù)來源和主產(chǎn)區(qū)分為東黨、潞黨、臺黨、西黨和條黨等[2,3]。潞黨的原植物為黨參,主產(chǎn)于山西晉東南的陵川、平順、黎城等地,歷來被認為是黨參的道地藥材。目前在山西平順縣和陵川縣已建成了潞黨質(zhì)量管理規(guī)范(GAP)種植基地。黨參主要化學(xué)成分有多糖、黨參苷、甾醇類、三萜類、生物堿、內(nèi)酯類、香豆素類等[3-6],藥理實驗表明黨參中含有的蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ具有明顯的抗炎活性,黨參苷I具補氣功效[5,6]。目前對黨參的質(zhì)量評價研究包括以薄層掃描法測定甾醇類、三萜類[3],HPLC 法測定黨參炔苷[7]、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ[8-10]等的含量。中藥指紋圖譜技術(shù)的整體性和模糊性,與中醫(yī)理論的整體性和模糊性相一致,近年來,中藥指紋圖譜在中藥材均一性評價方面已顯示出獨特的優(yōu)勢。目前,已有文獻對川黨[11,12]、甘肅白條黨[13]進行了指紋圖譜研究,而對于潞黨指紋圖譜的研究未見文獻報道。王秀文等[14]對不同生長年限的山西黨參進行了指紋圖譜研究,可明顯區(qū)分不同生長年限黨參樣品,但是該指紋圖譜共有峰較少,不能作為潞黨的特征指紋圖譜。黨參化學(xué)成分結(jié)構(gòu)類型多樣,成分復(fù)雜,在同一波長下進行指紋圖譜分析難以同時表征所有成分。本實驗應(yīng)用高效液相色譜法,針對極性與非極性成分的化學(xué)特點,首次對潞黨的極性與非極性成分進行指紋圖譜研究,并分別建立不同的色譜條件,結(jié)果表明所建立的方法靈敏,可操作性強,重現(xiàn)性好,可作為黨參藥材極性與非極性成分指紋圖譜研究的基礎(chǔ),并為潞黨參的質(zhì)量控制提供參考。
1.1 藥品與試劑 蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(上海中藥標準化研究中心),黨參苷Ⅰ(自制);乙腈為色譜純(北京迪馬公司);其他試劑均為分析純。黨參樣品共計12個經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅教授鑒定為黨參原植物正品Codonopsispilosula(Franch.)Nannf,樣品收集見表 1。
表1 黨參藥材來源Tab 1 Studied samples of Radix Codonopsis
1.2 儀器 高效液相色譜儀(美國 Waters,Breeze系統(tǒng),1 525泵,2 487紫外檢測器),Breeze色譜工作站;Diamonsil C18(5 μm,200 mm ×4.6 mm)色譜柱(DIKMA公司);Sartorious電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。
2.1 潞黨參非極性成分指紋圖譜研究
2.1.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(200 mm×4.6 mm,5 μm),檢測波長:230 nm;流速:1.0 ml/min;柱溫25℃;流動相:乙腈A-水B,梯度洗脫(0-10 min,40%A;10 -15 min,40%A -50%A;15-25 min,50%A;25 -30 min,50%A -68%A;30-45 min,68%A;45 -50 min,68%A -100%A;50 -60 min,100%A)。
2.1.2 樣品溶液的制備與測定
2.1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品適量,加甲醇制成96 μg/ml的溶液。
2.1.2.2 供試品溶液的制備 取黨參藥材粗粉5.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加石油醚(60-90℃)50 ml超聲提取30 min,放冷,濾過,濾液回收,水浴蒸干,甲醇溶解并定容至5 ml,搖勻,備用,臨用前過 0.45 μm微孔濾膜過濾,即得供試品溶液。
2.1.2.3 樣品測定 取樣品溶液20 μl注入高效液相色譜儀,230 nm檢測,記錄60 min內(nèi)的色譜峰及其保留時間和峰面積。
2.1.3 方法學(xué)考察 按照《中國藥典》2010年版一部中藥質(zhì)量標準分析方法驗證指導(dǎo)原則的要求,對上述方法進行方法學(xué)驗證。
2.1.3.1 穩(wěn)定性 取陵川黨參2號樣品制備供試品溶液,分別在 0,2,4,8,16 h 檢測指紋圖譜,結(jié)果表明,≥5%總峰面積的各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%,表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好,符合指紋圖譜研究技術(shù)要求。
2.1.3.2 精密度 取陵川黨參2號樣品制備的供試品溶液,連續(xù)進樣5次,結(jié)果表明≥5%總峰面積的各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%,表明精密度良好,符合指紋圖譜研究技術(shù)要求。
2.1.3.3 重復(fù)性 取陵川黨參2號樣品5份,平行制備5份供試品溶液,分別檢測指紋圖譜,結(jié)果表明≥5%總峰面積的各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%,表明樣品制備方法重復(fù)性良好,符合指紋圖譜研究技術(shù)要求。
2.1.4 樣品測定及指紋圖譜共有模式建立 按照
2.1.1色譜條件測定了12批黨參藥材非極性部分的指紋圖譜,山西栽培潞黨參藥材非極性部分的典型指紋圖譜見圖1。
在選定條件下,色譜圖相鄰兩峰分離度之和∑R與色譜峰總峰面積之和∑S均為最大,理論塔板數(shù)按蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ峰計算不低于20 000。
選取山西栽培潞黨樣品1-10號,用國家藥典委員會編寫的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”來推導(dǎo)潞黨非極性指紋圖譜的共有模式,以山西陵川黃松背(GAP種植基地)的色譜圖作為參照譜對10批不同潞黨的色譜圖進行自動匹配(圖2),構(gòu)建潞黨參非極性成分指紋圖譜(R譜圖),對1-10號樣品的各個峰進行比對分析,共找到9個共有峰,將蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ作為S峰。取S峰為參照峰,以各共有峰的保留時間分別除以參照峰的保留時間計算1-8號峰及S峰的相對保留時間(min,±s),分別為 0.132 8 ±0.012 7(1),1(S),1.470 9 ±0.004 0(2),1.498 7 ±0.004 4(3),1.734 3 ±0.005 3(4),1.914 6 ±0.005 2(5),1.948 0 ±0.005 9(6),2.451 8 ±0.011 7(7),2.737 6 ±0.014 8(8)。
圖1 潞黨參藥材1號樣品非極性部分HPLC指紋圖譜(S峰為蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ峰)Fig 1 HPLC fingerprint of nonpoalr constituents of Radix Codonopsis(S-atractylenoideⅢ)
圖2 10批黨參藥材匹配后HPLC指紋圖譜Fig 2 Fingerprint of 10 batches of samples
在中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件中使用夾角余弦法進行相似度計算,相似度評價結(jié)果見表2。
表2 10批黨參藥材相似度結(jié)果Tab 2 Results of similarity of 10 batches of Radix Codonopsis samples
結(jié)果顯示,1-10號樣品中,除7號樣品外,9批黨參藥材與共有指紋圖譜的相似度均大于0.90,而1、2、3、5、6、10 號樣品與共有指紋圖譜的相似度均高于0.95,說明山西栽培潞黨參藥材的非極性成分具較好的一致性。7號樣品與共有模式的相似度較低,僅為0.87,這種差異有待于進一步增加樣本數(shù)研究。
用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件處理,將山西10批栽培潞黨藥材生成的指紋圖譜共有模式與方山野黨及甘肅隴西黨參比較,結(jié)果見圖3及表2。
圖3 方山野黨、甘肅隴西黨參與10批藥材生成的指紋圖譜共有模式比較Fig 3 Fingerprint of Fangshan sample(S11),Gansu sample(S12)and reference fingerprint of 10 batches
由11與12號樣品的相似度結(jié)果可見,方山野黨、甘肅隴西黨參非極性部分色譜圖和2.1.4生成的潞黨非極性指紋圖譜共有模式有較大差異,其蒼術(shù)內(nèi)醋Ⅲ峰面積均明顯小于山西栽培潞黨,與指紋圖譜共有模式相似度分別僅為0.22和0.44,其原因在于這2份黨參均為非道地產(chǎn)區(qū)黨參,與山西栽培潞黨在非極性成分上差異巨大。由于本次實驗樣本數(shù)有限,這種差異有待增加樣本數(shù)進一步研究。
2.2 黨參極性成分指紋圖譜研究
2.2.2 樣品溶液的制備與測定
2.2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取黨參苷Ⅰ對照品適量,加50%甲醇溶解,搖勻,即得。
2.2.2.2 供試品溶液的制備 取2.1.2項下石油醚提取后烘干的藥渣,加入50 ml甲醇,超聲30 min,濾過,濾液回收,水浴蒸干,蒸餾水溶解,正丁醇萃取(20 ml,20 ml,20 ml),收集正丁醇層,揮干,甲醇溶解并定容至 5 mL,搖勻,備用,臨用前過0.45 μm微孔濾膜過濾,得供試品溶液。
2.2.2.3 樣品測定 取樣品溶液20 μl注入高效液相色譜儀,266 nm檢測,記錄60 min內(nèi)的色譜峰及其保留時間和峰面積。
2.2.3 方法學(xué)考察 按照《中國藥典》2010年版一部中藥質(zhì)量標準分析方法驗證指導(dǎo)原則的要求,對上述方法進行方法學(xué)驗證。
2.2.3.1 穩(wěn)定性 取陵川黨參2號樣品制備供試品溶液,分別在 0,2,4,8,16 h 檢測指紋圖譜,結(jié)果表明,≥5%總峰面積的各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%,表明樣品在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好,符合指紋圖譜研究技術(shù)要求。
航務(wù)人員(負責(zé)航展布置等):“我們就天天跟那老外Yes,No的……公司要能提供免費培訓(xùn)那肯定好,那肯定參加,大家都愿意,畢竟你那個要對話嘛,就口語,寫作啥的都不管用……”。
2.2.3.2 精密度 取陵川黨參2號樣品制備的供試品溶液,連續(xù)進樣5次,結(jié)果表明≥5%總峰面積的各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%,表明精密度良好,符合指紋圖譜研究技術(shù)要求。
2.2.3.3 重復(fù)性 取陵川黨參2號樣品5份,平行制備5份供試品溶液,分別檢測指紋圖譜,結(jié)果表明≥5%總峰面積的各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%,表明樣品制備方法重復(fù)性良好,符合指紋圖譜研究技術(shù)要求。
2.2.4 樣品測定及指紋圖譜共有模式建立 按照2.2.1色譜條件測定了12批黨參藥材極性部分的指紋圖譜,潞黨參極性部分指紋圖譜見圖4。
在選定條件下,色譜圖相鄰兩峰分離度之和∑R與色譜峰總峰面積之和∑S均為最大,理論塔板數(shù)按黨參苷Ⅰ峰計算不低于4 000。
選取山西栽培潞黨樣品1-9號,用國家藥典委員會編寫的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”來推導(dǎo)潞黨極性指紋圖譜的共有模式,以山西陵川黃松背(GAP種植基地)的色譜圖作為參照譜對9批不同潞黨參的色譜圖進行自動匹配(圖5 ),構(gòu)建潞黨參極性成分指紋圖譜(R譜圖)。
圖4 潞黨參藥材1號樣品極性部分HPLC指紋圖譜(S為黨參苷Ⅰ峰)Fig 4 HPLC fingerprint of polar constituents of No.1 sample of Radix Codonopsis(S-tangshenosideⅠ)
圖5 9批黨參藥材極性成分匹配后HPLC圖譜Fig 5 HPLC fingerprint of 9 batches of samples(R-reference fingerprint)
對各樣品的各個峰進行比對分析,共找到13個共有峰,將黨參苷Ⅰ作為S峰。取S峰為參照峰,以各共有峰的絕對保留時間分別除以參照峰的保留時間計算1-12號峰及S峰的相對保留時間(min,±s),分別為0.514 4 ±0.005 9(1),0.731 1 ±0.008 7(2),0.804 9 ±0.010 0(3),0.900 2 ±0.013 3(4),1(S),1.380 6 ±0.012 0(5),1.657 1 ±0.013 2(6),1.752 3 ± 0.014 7(7),1.947 7 ± 0.015 0(8),2.111 9 ± 0.017 4(9),2.993 1 ± 0.030 4(10),3.164 6 ±0.031 9(11),3.467 7 ±0.034 7(12)。
在中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件中使用夾角余弦法進行相似度計算,相似度評價結(jié)果見表3。
表3 9批黨參藥材相似度結(jié)果Tab 3 Results of similarity of 9 batches of Radix Codonopsis samples
結(jié)果顯示,1-9號樣品中,除9號藥材外,其余8批黨參藥材與潞黨極性成分指紋圖譜共有模式之間的相似度均大于0.96,表明9批潞黨參藥材的極性成分也具有較好的一致性。9號樣品與共有模式的差異較大,其相似度僅為0.86,這種差異有待于進一步增加樣本數(shù)研究。
用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件處理,將山西9批栽培潞黨藥材生成的極性成分指紋圖譜共有模式與方山野黨及甘肅隴西黨參比較,結(jié)果見圖6。
圖6 方山野黨、甘肅隴西黨參與9批藥材生成的共有圖譜比較Fig 6 Fingerprint of Fangshan sample(S11),Gansu sample(S12)and reference fingerprint of 9 batches
11 與12 號樣品的相似度結(jié)果顯示,方山野黨、甘肅隴西黨參極性部分色譜圖和2.2.4生成的潞黨參極性指紋圖譜共有模式有一定差異,與指紋圖譜共有模式相似度分別為0.86和0.85,說明這2份非道地產(chǎn)區(qū)的黨參樣品與山西栽培潞黨在極性成分上有一定差異。由于本次實驗樣本數(shù)有限,這種差異有待增加樣本數(shù)進一步研究。
3.1 由于黨參的化學(xué)成分復(fù)雜,結(jié)構(gòu)類型多樣,極性和非極性成分差異較大,在一個固定波長下進行指紋圖譜分析難以表征所有化學(xué)成分,本文首次對極性和非極性成分分別進行提取并建立HPLC指紋圖譜。
3.2 非極性部分的常用提取溶劑有乙醚、氯仿、石油醚等,考慮到乙醚及氯仿的毒性,選擇石油醚為提取溶劑,對石油醚提取后藥材中剩余極性成分的提取考察了95%乙醇和甲醇的提取效果,結(jié)果表明以甲醇作為提取溶劑所得到的峰分離較好,因此選擇了甲醇作為提取溶劑。對于提取方法,考察了超聲與回流提取對HPLC指紋峰的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流與超聲提取兩者色譜圖相差不大,由于超聲提取操作簡單,便于多個樣品平行操作,選擇超聲提取作為提取方法。對提取時間,考察了15 min,30 min和45 min的提取效果,發(fā)現(xiàn)30 min與45 min色譜峰數(shù)量及大小區(qū)別不明顯,所以提取時間定為30 min。
3.3 對Hypersil C18和 Diamonsil C18色譜柱的考察結(jié)果表明,Diamonsil C18色譜柱分離效果較好,故選用Diamonsil C18色譜柱;實驗過程中對乙腈-水和甲醇-水線性梯度洗脫進行了流動相考察,結(jié)果顯示乙腈-水線性梯度洗脫效果最佳;非極性成分指紋圖譜研究中,通過對220 nm,230 nm,240 nm,254 nm,274 nm,284 nm,311 nm 波長進行實驗比較,發(fā)現(xiàn)230 nm下的色譜峰數(shù)目較多,基線穩(wěn)定,分離效果較好,故選擇230 nm作為檢測波長;極性成分指紋圖譜研究中,通過對254 nm,266 nm,284 nm,305 nm波長進行實驗比較,發(fā)現(xiàn)266 nm下黨參苷Ⅰ吸收度大,色譜圖分離效果好,峰形對稱,故選擇266 nm為指紋圖譜的檢測波長。
對黨參極性及非極性成分指紋圖譜均進行了80 min色譜圖的測定,譜圖顯示,60 min后無色譜峰出現(xiàn),故檢測時間定為60 min。
3.4 方法學(xué)考察表明,穩(wěn)定性、精密度、制備方法重復(fù)性均符合指紋圖譜分析技術(shù)要求,潞黨中極性和非極性成分的指紋圖譜中分別確定了13和9個共有峰。中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件分析結(jié)果表明山西栽培潞黨參的極性和非極性成分均具有較好的一致性,所建立的HPLC指紋圖譜可作為山西潞黨參的特征圖譜,該分析方法能夠更全面、有效地評價不同產(chǎn)地黨參藥材內(nèi)在質(zhì)量的均一性。
3.5 通過對潞黨極性與非極性成分指紋圖譜研究,發(fā)現(xiàn)山西栽培黨參與山西方山野黨、甘肅栽培黨參極性成分相似,而非極性成分存在較大差異,原因可能是方山野黨和甘肅隴西黨參的生長條件與山西潞黨不同,然而本次實驗中樣本數(shù)較少,這種差異有待增加樣本數(shù)進一步研究。
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Study on HPLC fingerprint of polar and nonpolar components in Radix Codonopsis
LI Zhen-yu1,WANG Ai-na1,LIU Xiao-jie1,2,XUE Shui-yu1,2,QIN Xue-mei1,2*,GUO Xiao-qing1,ZHANG Li-zeng1,(1Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine,Shanxi University,Taiyuan 030006,China;2College of Chemistry and Chemical Engineering,Shanxi University;*Corresponding author,E-mail:qinxm@sxu.edu.cn)
ObjectiveTo establish the fingerprint of polar and nonpolar components in Radix Codonopsis for providing a basis for quality control of Radix Codonopsis.MethodsFingerprints of polar and nonpolar components in Radix Codonopsis were established by HPLC-UV on Diamonsil C18column(200 mm ×4.6 mm,5 μm)gradiently eluted with acetonitrile-water.The detection wavelengths were 266 nm and 230 nm,respectively.ResultsNine and thirteen common peaks were found in the fingerprint of nonploar and polar components,respectively.The similarity of fingerprints ofCodonopsis pilosula(Franch.)Nannf from Lingchuan,Shanxi Province was higher(>0.87).ConclusionThe HPLC fingerprint established in this study is convenient,accurate and reproductive,and could be used as the evaluation basis for quality homogeneity ofCodonopsis pilosula(Franch.)Nannf.
Radix Codonopsis;HPLC;fingerprint;polar components;nonpolar components
R927
A
1007 -6611(2011)01 -0056 -07
10.3969/J.ISSN.1007 -6611.2011.01.015
山西省科技攻關(guān)基金資助項目(052018)
李震宇,男,1980-03生,博士,講師,E-mail:lizhenyu@sxu.edu.cn.
2010-10-08]