羅氏COBAS6000全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀性能驗證

譚曉輝， 王 勇 (南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)系， 廣州 5055;重慶市公安局刑警總隊技術(shù)處)

羅氏COBAS6000全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀性能驗證

譚曉輝1， 王 勇2(1南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)系， 廣州 510515;2重慶市公安局刑警總隊技術(shù)處)

目的 按ISO15189要求對羅氏COBAS 6000全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的性能進(jìn)行驗證。 方法 對甲胎蛋白(alpha－fetoprotein，AFP)的精密度、準(zhǔn)確度、臨床可報告范圍(clinical reportable range，CRR)、分析測量范圍(analytical measurement range，AMR)、參考區(qū)間進(jìn)行驗證實驗。 結(jié)果 批內(nèi)精密度變異系數(shù)(coefficient variation，CV)高低值分別為3.28%和3.46%;日間精密度CV高低值分別為4.39%和5.13%，均小于廠家提供的CV(10%)。相對偏差為0.862%，小于5%。分析測量范圍為0.80－1 200 ng/ml，參考區(qū)間為0－20.00 ng/ml，臨床可報告范圍為0－60 000 ng/ml。 結(jié)論 羅氏COBAS 6000全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的性能與廠家提供的資料基本一致，故可用其進(jìn)行臨床標(biāo)本的檢驗工作，所得結(jié)果具有可信性。

羅氏COBAS 6000全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀; 甲胎蛋白; 性能驗證

羅氏COBAS6000全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(以下簡稱6000)是國內(nèi)醫(yī)療檢驗的大型主力檢測系統(tǒng)，它是當(dāng)今腫瘤標(biāo)志物檢測靈敏度最高的儀器，其出色的檢測性能得到國內(nèi)外實驗室的一致認(rèn)同。依據(jù)《醫(yī)學(xué)實驗室和能力的要求》(ISO15189)和美國病理家學(xué)會(CAP)要求參加其認(rèn)可的實驗室，在開展某一檢測項目前，都需要進(jìn)行精密度、準(zhǔn)確度、分析測量范圍、參考區(qū)間等系統(tǒng)評價，達(dá)到要求后才能應(yīng)用于臨床常規(guī)檢測。按照上述規(guī)定，本實驗室對羅氏COBAS6000進(jìn)行了甲胎蛋白(alpha－fetoprotein，AFP)，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)等檢測的方法學(xué)評價，現(xiàn)取AFP進(jìn)行報告。

1 材料

1.1 儀器與試劑 羅氏COBAS6000全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(德國，羅氏);羅氏原裝AFP試劑(批號為:12172)、低值校準(zhǔn)品AFP(批號為181641，濃度:5.32 ng/ml)、高值校準(zhǔn)品 AFP(批號:181641，濃度:59.53 ng/ml)，質(zhì)控品為羅氏原裝中值質(zhì)控(TM1:11.200 ng/ml，批號:181461)、高值質(zhì)控品(TM2:87.241 ng/ml，批號:181462)。

1.2 樣本 來源于廣州市健康體檢人群新鮮血標(biāo)本120份，選擇標(biāo)準(zhǔn):表面健康人(經(jīng)健康體檢，排除疾病/亞健康狀態(tài)/不良嗜好及用藥史者)，男女各60份。

2 方法

2.1 精密度驗證實驗

2.1.1 批內(nèi)精密度 選擇 TM1(11.200 ng/ml)和TM2(87.241 ng/ml)兩個濃度的質(zhì)控品，連續(xù)測定20次，分別計算其平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、變異系數(shù)(CV)。

2.1.2 日間精密度 選擇TM1和TM2兩個濃度的質(zhì)控品，每天測定一次，連續(xù)測定20 d，計算其平均值、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)、變異系數(shù)(CV)。

2.2 準(zhǔn)確度驗證實驗 以2009年衛(wèi)生部第一次室間質(zhì)評回報靶值為標(biāo)準(zhǔn)，用臨床實驗室上報結(jié)果與靶值的相對偏倚計算相對偏移(SE%)，以SE%≤1/2 CLIA88允許總誤差(TEa)，即SE%≤5%為可接受范圍。

2.3 分析測量范圍和線性相關(guān)驗證實驗 分析測量范圍(analytical measurement range，AMR)是指患者標(biāo)本未經(jīng)任何處理(稀釋、濃縮或者其他處理)，由檢測系統(tǒng)直接檢測得到的可靠的檢測范圍。按參考文獻(xiàn)［1］和美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)NCCLS EP6－A2文件［2］選擇低濃度(L)和高濃度(H)患者標(biāo)本各一份，濃度最好達(dá)到給定的上下限，并按照5L、4L+H、3L+2H、2L+3H、L+4H、5H 的比例混合成6 個混合標(biāo)本，每個濃度的樣本重復(fù)檢測4次。以預(yù)期值為X，測定均值為Y，計算回歸方程:Y=bX+a，若相關(guān)系數(shù)R2≥0.975，b在 0.97 －1.03 范圍內(nèi)，a與0無顯著性差異。結(jié)果為可接受。若b＜0.95，提示可能b和1之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義［3］。

2.4 參考區(qū)間驗證實驗 參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所 CLSI C28－A2［4］文件，R= 測定結(jié)果在參考范圍內(nèi)的例數(shù)/總測定例數(shù)，≥95%即合格。選擇120份體檢合格的健康人標(biāo)本，在檢測系統(tǒng)上進(jìn)行測定，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計并與儀器說明書提供的參考區(qū)間進(jìn)行比較。若120份標(biāo)本的檢測結(jié)果均在儀器說明書提供的參考區(qū)間內(nèi)或僅有≤5%的值超出，則驗證通過。否則應(yīng)進(jìn)行參考區(qū)間的確立實驗。

2.5 臨床可報告范圍(CRR)驗證 臨床可報告范圍為患者標(biāo)本經(jīng)稀釋、濃縮或者其他處理后，向臨床所能報告的結(jié)果范圍。先進(jìn)行稀釋回收試驗，確定標(biāo)本稀釋后可靠檢測濃度低限。選擇AFP濃度在AMR內(nèi)的高值標(biāo)本一份，分別對其進(jìn)行2，5，10，20，50，100倍稀釋，連續(xù)測定4次，用平均值與預(yù)期值比較，計算回收率，按儀器說明書要求，回收率在80%－120%內(nèi)，結(jié)果可以接受。確定其最大稀釋度，結(jié)合功能靈敏度和臨床決定水平確定臨床可報告范圍［5］。

3 結(jié)果

3.1 精密度驗證 結(jié)果顯示，實測CV小于廠家提供的CV，判斷標(biāo)準(zhǔn)CV＜10%，見表1。

表1 質(zhì)控批內(nèi)精密度與日間精密度Tab 1 The inter-assay precision and between-day precision of Roche COBAS6000 automatic electrochemiluminescence immunoassay analyzer

3.2 準(zhǔn)確度實驗 結(jié)果表明，實測平均偏差為0.862(見表2)，少于用臨床實驗室上報結(jié)果與靶值的相對偏倚計算相對偏移(SE/%)，SE≤5%為可接受范圍。

表2 準(zhǔn)確度實驗結(jié)果Tab 2 The accuracy of Roche COBAS6000 automatic electrochemiluminescence immunoassay analyzer

3.3 分析測量范圍和線性相關(guān)實驗結(jié)果 結(jié)果顯示，實驗實測值與預(yù)期值成線性關(guān)系(見圖1)，a=11.538，b=0.985 6，R2=0.999 6，結(jié)果符合統(tǒng)計學(xué)要求。

3.4 參考區(qū)間實驗結(jié)果 本實驗測定正常人結(jié)果所提供的參考范圍的比率R=96.7%≥95%。標(biāo)本的項目結(jié)果均在廠家提供的生物參考區(qū)間范圍內(nèi)(0－20.00μg/L)或者《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版提供的生物參考區(qū)間內(nèi)，即:可以直接引用廠家提供的參考區(qū)間作為這些檢測指標(biāo)的參考區(qū)間。

圖1 甲胎蛋白分析測量范圍Fig 1 Analytical measurement range of alpha－fetaprotein

3.5 臨床可報告范圍 本項目最大稀釋度為1∶50，以線性最高濃度1 200 ng/ml計算，本項目可報告的最高濃度為60 000 ng/ml，最終結(jié)果表明，本實驗系統(tǒng)的可報告范圍0－60 000 ng/ml為可接受，見表3。

表3 回收率實驗結(jié)果Tab 3 Results of recovery test

4 討論

雖然電化學(xué)發(fā)光法檢測AFP采用羅氏的封閉檢測系統(tǒng)，試劑和耗品都來自于原廠，但其說明書提供的所有參數(shù)都是廠家在最佳條件下完成的，而實驗室間的條件存在較大的差異，因此每個實驗室都必須按各自的檢測系統(tǒng)建立和驗證方法學(xué)參數(shù)，本次AFP的批內(nèi) CV分別為3.46%和3.28%;日間CV分別為5.13%和4.39%，均低于廠家說明書提供的參數(shù)，同時偏倚是明顯小于衛(wèi)生部或者CLIA88提供的偏倚，說明本實驗室的檢測系統(tǒng)是可以用于臨床檢驗診斷研究的。

目前國內(nèi)大部分實驗室都采用說明書提供的分析靈敏度作為該方法的最低檢測限，這可能存在系統(tǒng)差異，更可能存在著引用錯誤，按最新的觀點，功能靈敏度才是該方法的最低檢測限，因此每個實驗室應(yīng)該建立自己的功能靈敏度，不宜直接引用廠家提供的參數(shù)［5］。功能靈敏度是以日間重復(fù)變異系數(shù)(CV)為20%時對應(yīng)檢測限樣品具有的平均濃度，確定為檢測系統(tǒng)或方法可定量報告分析物的最低濃度或其他量值的限值。通過對某些定量測試項目的靈敏度評價，評估該檢測系統(tǒng)可檢測最低分析物濃度，為分析測量范圍和臨床可報告范圍的低限值確定做參考。線性驗證的目的是驗證該方法的最高檢測值和高、低檢測值之間是否呈線性關(guān)系［6］。分析測量范圍驗證實驗所得到的結(jié)果在坐標(biāo)圖上呈現(xiàn)良好的線性趨勢，得直線回歸Y=bX+a。a=11.538，b=0.986，R2=0.999 6 則可判斷該測定方法分析測量范圍在廠家給定的高、低限濃度之間，是滿足臨床實驗要求結(jié)果。

參考區(qū)間盡管驗證結(jié)果得出“可以直接引用廠家提供的參考區(qū)間作為這些檢測指標(biāo)的參考區(qū)間”的結(jié)論，但由于時間的緊迫和取樣的片面性、局限性，同時標(biāo)本數(shù)目偏少，所得出的結(jié)果不能完全反映當(dāng)?shù)貙嶋H的情況，在國內(nèi)也出現(xiàn)過廠家提供的參考區(qū)間不符合實驗室使用的例子。所以這樣的結(jié)果不能真實、完全地反映當(dāng)?shù)氐那闆r，但考慮到成本以及精力，所以就暫時按照廠家給定的參考區(qū)間進(jìn)行臨床檢驗。如果要得出實際的當(dāng)?shù)厝巳旱膮⒖紖^(qū)間，就需要更加嚴(yán)格的取樣人群的標(biāo)準(zhǔn)，采集更多的健康人的標(biāo)本，依據(jù)檢測結(jié)果的分布情況及臨床疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇正確的統(tǒng)計方法進(jìn)行歸納分析并定期進(jìn)行評審。

臨床可報告范圍即定量檢測項目向臨床所能報告的結(jié)果范圍，患者標(biāo)本可經(jīng)稀釋、濃縮或其他處理，由實驗結(jié)果顯示1∶50倍稀釋為可接受的范圍對應(yīng)的可報告濃度為0－60 000 ng/ml，該濃度已經(jīng)可以滿足AFP的臨床診斷。

國內(nèi)外研究報道電化學(xué)發(fā)光免疫分析ECLIA精密度高、靈敏度好、準(zhǔn)確度精確、線性范圍寬［7－9］，本次實驗表明羅氏COBAS6000電化學(xué)分析儀的精密度、靈敏度、線性范圍的驗證結(jié)果與廠家提供的數(shù)據(jù)是相吻合的。綜上所述，羅氏COBAS6000電化學(xué)分析系統(tǒng)AFP檢測的主要分析性能結(jié)果與廠家規(guī)定的性能一致，符合質(zhì)量目標(biāo)要求，可用于臨床AFP的檢測。

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Performance verification of Roche COBAS6000 automatic electrochemiluminescence immunoassay analyzer

TAN Xiao－h(huán)ui1，WANG Yong2(1Institute of Forensic Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China;2Corps of Chongqing Public Security Bureau Criminal Technology Division)

ObjectiveTo test and verify the system performance of Roche COBAS 6000 automatic electrochemiluminescence immunoassay analyzer according to the requirements of ISO15189.MethodsVerification experiments were taken to measure the precision，accuracy，clinical reportable range(CRR)，analytical measurement range(AMR)，reference interval of alpha－fetoprotein(AFP).ResultsThe high and low values of coefficient variation(CV)of inter－assay were 3.28%and 3.46% ，and those of between－day precision were 4.39%and 5.13%，which were all less than the CV provided by the manufacturer(10%).Relative bias was 0.862%.Analytical measurement range was 0.80 － 1 200 ng/ml，the reference interval was 0 － 20.00 ng/ml，and the clinical reportable range was 0 －60 000 ng/ml.ConclusionThe basic performances of Roche COBAS6000 automatic electrochemiluminescence immunoassay analyzer are consistent with the data provided by the manufacturer，so it can be used to inspect the clinical samples and the results are credible.

Roche COBAS6000 automatic electrochemiluminescence immunoassay analyzer; alpha－fetoprotein; performance verification

R318.6

A

1007 －6611(2011)01 －0052 －04

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.01.014

譚曉輝，男，1983－07生，碩士，助理實驗師，E－mail:newman@fimmu.com.

2010－10－11］