宮頸腺癌中HPV16/18與P16的表達(dá)及其相關(guān)性

張 玲， 劉 峰， 王全紅 (山西醫(yī)科大學(xué)病理教研室， 太原 0000;山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院;山西省腫瘤醫(yī)院病理科)

宮頸腺癌中HPV16/18與P16的表達(dá)及其相關(guān)性

張 玲1， 劉 峰2， 王全紅3(1山西醫(yī)科大學(xué)病理教研室， 太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院;3山西省腫瘤醫(yī)院病理科)

目的 探討各類型宮頸腺癌與HPV16/18感染的關(guān)系，分析HPV16/18的感染率與P16表達(dá)之間的相關(guān)性。 方法應(yīng)用原位雜交及免疫組織化學(xué)EnvisionTM二步法檢測(cè)31例宮頸管型腺癌，12例宮頸子宮內(nèi)膜樣腺癌，9例宮頸微偏腺癌中

HPV16/18及P16的表達(dá)情況，另選36例宮頸鱗癌作對(duì)照。 結(jié)果 ①微偏腺癌中HPV16/18的檢出率低于其他各組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);宮頸管型腺癌、子宮內(nèi)膜樣腺癌中HPV16/18的檢出率與鱗癌相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②微偏腺癌中P16蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率低于其他各組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。③所有HPV陽(yáng)性患者P16的表達(dá)明顯高于所有HPV陰性患者，P16的陽(yáng)性表達(dá)率與HPV16/18感染呈正相關(guān)(P＜0.05)。 結(jié)論 ①宮頸管型腺癌及宮頸子宮內(nèi)膜樣腺癌與HPV16/18感染相關(guān)，而宮頸微偏腺癌可能與HPV16/18的感染無(wú)關(guān)。②P16蛋白的過(guò)表達(dá)可能參與了部分普通型宮頸腺癌的發(fā)生、發(fā)展，但在微偏腺癌中可能不起重要作用。③P16蛋白的高表達(dá)與HPV感染密切相關(guān)。

宮頸腺癌; 微偏腺癌;HPV16/18;P16

宮頸腺癌較鱗癌少見(jiàn)，大約占宮頸腫瘤的10%－30%，近幾年來(lái)宮頸腺癌的發(fā)病率逐漸上升［1，2］。人乳頭瘤狀病毒(HPV)與宮頸鱗癌發(fā)生的密切關(guān)系已經(jīng)得到肯定。一些研究也揭示在宮頸腺癌中HPV的感染率較高［3］。宮頸微偏腺癌是一種罕見(jiàn)的高分化腺癌，僅占宮頸腺癌的1%－3%，因?yàn)槠渑R床表現(xiàn)缺乏特異性，細(xì)胞學(xué)異型性輕微，病理診斷非常困難，常易誤診和漏診。1870年Gusserow首次將此瘤稱之為惡性腺瘤(malignant adenocarcino ma)［4］，1975 年 Hurt等［5］認(rèn)為其病理形態(tài)是稍偏離正常宮頸腺體的一種癌，是高度分化的腺癌，建議采用低離正性腺癌或微小偏離性腺癌(minimal deviation adenocarcinoma，MDA)一詞代替惡性腺瘤。

宮頸MDA比較罕見(jiàn)，因此對(duì)其HPV的檢測(cè)及相關(guān)性的研究很少，本研究通過(guò)原位雜交及免疫組化檢測(cè)了各類型宮頸腺癌(包括9例微偏腺癌)中HPV16/18及P16的表達(dá)，從而探討HPV16/18與各類型宮頸腺癌尤其是微偏腺癌發(fā)生的關(guān)系，并分析HPV16/18感染與P16表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 宮頸組織標(biāo)本 研究標(biāo)本取自山西省腫瘤醫(yī)院病理科1996－08～2008－03間住院手術(shù)病例共88例，包括宮頸微偏腺癌9例，宮頸管型腺癌31例，宮頸子宮內(nèi)膜樣腺癌12例，宮頸鱗癌36例。

1.2 原位雜交 HPV16/18原位雜交試劑盒為美國(guó)ZYMED公司產(chǎn)品(購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司)，雜交方法為:切片常規(guī)脫蠟;100%乙醇浸泡5 min后空氣干燥;胃蛋白酶37℃孵育30 min;逐級(jí)酒精脫水后空氣干燥;每張切片加30 μl探針，蓋上蓋玻片;95℃變性5 min;37℃雜交過(guò)夜;PBS緩沖液中浸泡10 min，去掉蓋玻片，每張切片中加入5－6滴雜交洗液，37℃孵育15 min;加入50 μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗地高辛抗體37℃孵育30 min;DAB顯色;復(fù)染;脫水;透明;封片。

1.3 免疫組化 P16的檢測(cè)采用免疫組化EnvisionTM二步法，鼠抗人單克隆抗體P16(ZM-0205)及二步法試劑盒均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。染色步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定 HPV16/18原位雜交結(jié)果判定:細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為HPV16/18陽(yáng)性。免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下:隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取平均染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，≤20%為P16缺失或低表達(dá)，＞20%為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用Fisher確切概率及χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 HPV16/18在各類型宮頸腺癌及鱗癌中的表達(dá) HPV16/18 DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒。HPV16/18 DNA在9例宮頸微偏腺癌中有1例HPV16陽(yáng)性(占11.11%);在31例宮頸管型腺癌中有21例陽(yáng)性(占67.74%);在12例子宮內(nèi)膜樣腺癌中有6例陽(yáng)性(占50%);在36例宮頸鱗癌標(biāo)本中有30例陽(yáng)性(占83.33%);HPV16/18 DNA在宮頸微偏腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率低于其他各組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)表1);宮頸管型腺癌、子宮內(nèi)膜樣腺癌中HPV16/18的檢出率與鱗癌相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

在21例HPV陽(yáng)性的宮頸管型腺癌中HPV16陽(yáng)性13 例(61.9%)，HPV18 陽(yáng)性10 例(47.62%)，雙重感染2例(9.52%)，見(jiàn)表2;在6例HPV陽(yáng)性的子宮內(nèi)膜樣腺癌中 HPV16陽(yáng)性3例(50%)，HPV18陽(yáng)性4例(66.67%)，雙重感染1 例(16.67%);在30例HPV陽(yáng)性的宮頸鱗癌中HPV16陽(yáng)性23例(76.67%)，HPV18 陽(yáng)性11 例(36.67%)，雙重感染4 例(13.33%)，見(jiàn)表 2。

表1 各類型宮頸癌組織中HPV16/18、P16的表達(dá) 例(%)Tab 1 Expression of HPV16/18 and P16 in different types of cervical adenocarcinoma cases(%)

表2 各類型宮頸癌組織中HPV感染類型 例(%)Tab 2 The types of HPV infection in different types of cervical adenocarcinoma cases(%)

2.2 P16在宮頸微偏腺癌、宮頸管型腺癌、子宮內(nèi)膜樣腺癌及宮頸鱗癌中的表達(dá) P16蛋白的陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，部分細(xì)胞核也可見(jiàn)著色。P16蛋白在宮頸微偏腺癌、宮頸管型腺癌、子宮內(nèi)膜樣腺癌及宮頸鱗癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為11.11%(1/9)、74.19%(23/31)、58.33%(7/12)、86.11%(31/36)。P16蛋白在宮頸微偏腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率低于其他各組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)表1)。

2.3 各類型宮頸癌組織中HPV16/18感染與P16表達(dá)的相關(guān)性 在58例HPV感染的陽(yáng)性病例中P16陽(yáng)性51例(87.93%)，而在30例HPV感染的陰性病例中P16陽(yáng)性11例(36.67%)，前者明顯高于后者(P＜0.05，見(jiàn)表3)。且P16蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與HPV16/18感染呈正相關(guān)(Phi=0.533，P＜0.05)。

表3 HPV感染與P16表達(dá)的相關(guān)性Tab 3 The correlation between HPV infection and expression of P16

3 討論

人乳頭瘤狀病毒(HPV)與宮頸鱗癌發(fā)生的密切關(guān)系已經(jīng)得到肯定。宮頸腺癌與高危型人乳頭狀病毒HPV16/18感染亦密切相關(guān)。本研究顯示宮頸管型腺癌及子宮內(nèi)膜樣腺癌中HPV16/18的感染率均較高，與宮頸鱗癌相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，在宮頸鱗癌中主要以HPV16感染為主，而在宮頸腺癌中HPV16及HPV18的感染率大致相當(dāng)。這與文獻(xiàn)［6］報(bào)道的宮頸鱗癌以HPV16感染為主，而宮頸腺癌以HPV18為主有差異，這可能與受檢者的地域、年齡、檢測(cè)方法都有一定的關(guān)系。

環(huán)化酶依賴性的激酶抑制蛋白P16與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，故稱為多重腫瘤抑制基因(MTS1)，在正常細(xì)胞周期中，細(xì)胞周期素cyclin D1與細(xì)胞周期素依賴激酶4形成cyclin D1-CDK4復(fù)合物，致Rb磷酸化，使抑癌基因Rb失去抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F啟動(dòng)DNA合成的功能，導(dǎo)致細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，細(xì)胞增殖。P16蛋白能與cyclin D1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CDK4，抑制cyclin D1-CDK4復(fù)合物的活性，使細(xì)胞停滯于G1期，從而抑制細(xì)胞增生和惡性轉(zhuǎn)化。此外，在正常細(xì)胞中，存在著一個(gè)負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)，即磷酸化Rb增加時(shí)，可引起P16表達(dá)增強(qiáng)，增加的P16與cyclin D1競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合CDK4，從而抑制CDK4活性，抑制細(xì)胞增殖。因此P16基因在上述某一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生異常，均可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和腫瘤發(fā)生。

P16作為一個(gè)抑癌因素在許多惡性腫瘤中是失活的，但是在宮頸腫瘤中，卻一直沒(méi)有發(fā)現(xiàn)P16基因變異或P16蛋白失活。相反，在宮頸鱗癌、宮頸腺癌進(jìn)行免疫組化染色時(shí)卻發(fā)現(xiàn)了P16的過(guò)度表達(dá)［7］。Milde-Langosch等［8］發(fā)現(xiàn)在 HPV陽(yáng)性的宮頸腺癌中，P16蛋白的陽(yáng)性率為93%，而在HPV陰性的宮頸腺癌中僅有41%表達(dá)P16蛋白，P16蛋白表達(dá)與宮頸腺癌中HPV16/18感染密切相關(guān)。本研究也證實(shí)了HPV16/18的感染率與P16蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)(P＜0.05)。因此認(rèn)為高危組的HPV所含有的E6、E7基因可整合入宿主的基因組內(nèi)，進(jìn)而分別使P53、Rb蛋白的功能失調(diào)，使宮頸上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，Rb通路失控，引起原本正常的P16蛋白反饋性高表達(dá)。

宮頸微偏腺癌(MDA)在宮頸腺癌中占1%－3%，其形態(tài)學(xué)上具有類似正常宮頸黏液腺的特征，而生物學(xué)行為卻表現(xiàn)為惡性，宮頸細(xì)胞學(xué)涂片甚至多次活檢可呈陰性，以至于不易早期發(fā)現(xiàn)。有文獻(xiàn)報(bào)道宮頸MDA特征性表達(dá)胃黏蛋白［9］，并且對(duì)宮頸MDA黏液成分的研究顯示其所含黏蛋白成分的比例與正常宮頸腺上皮不同［10］。我們先前的研究顯示宮頸MDA與其他類型腺癌中CEA、Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)率均較高，但與其他類型腺癌不同的是，宮頸MDA中特征性表達(dá)胃黏蛋白 MUC6［11］。我們對(duì)9例MDA的黏液特殊染色也發(fā)現(xiàn):AB-PAS(奧辛藍(lán)－過(guò)碘酸雪夫氏)染色中MDA中腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)主要被PAS染成紅色，而正常宮頸腺上皮細(xì)胞質(zhì)均被染成紫色或紫羅蘭色;HID/AB(高鐵二胺－奧辛藍(lán))染色中正常宮頸腺上皮細(xì)胞既有黑色著色部位，又有藍(lán)色著色部位，以黑色為主。MDA中兩種著色均減少，只見(jiàn)少量腺體呈淺藍(lán)色。因此我們推測(cè)宮頸MDA與胃黏膜上皮化生有關(guān)。Toki等［12］用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)6例MDA的石蠟切片，僅發(fā)現(xiàn)1例HPV16陽(yáng)性，HPV18均陰性，并且通過(guò)原位雜交聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)該陽(yáng)性病例是一個(gè)低度鱗狀上皮內(nèi)病損疊壓在MDA病灶上造成的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10例宮頸MDA中僅1例HPV16陽(yáng)性，P16的陽(yáng)性表達(dá)率亦低于其他組的宮頸癌組織，因此我們認(rèn)為宮頸MDA可能是宮頸腺癌中的一種特殊類型，其病因及發(fā)病機(jī)制不同于常見(jiàn)的宮頸管型及子宮內(nèi)膜樣腺癌，結(jié)合Hee等［13］以及 Xu等［14］的研究結(jié)果，我們有理由認(rèn)為宮頸MDA可能與高危HPV16/18的感染無(wú)關(guān)。當(dāng)然，在以后的研究中我們會(huì)收集更多的病例，檢測(cè)更多亞型的HPV，應(yīng)用更先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步探討宮頸MDA的病因及發(fā)病機(jī)制。

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Expression of HPV16/18 and P16 in cervical adenocarcinoma and their correlation

ZHANG Ling1，LIU Feng2，WANG Quan-hong3(1Dept of Pathology，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China;2School of Forensic Medicine，Shanxi Medical University;3Dept of Pathology，Shanxi Tumor Hospital)

ObjectiveTo explore the infection of HPV16/18 in different types of cervical adenocarcinoma，and its correlation with expression of P16.MethodsHybridizationin situand EnvisionTMtwo-step method were used to evaluate the expression of HPV16/18 and P16 in 31 cases of endocervical adenocarcinoma，12 cases of endometrioid adenocarcinoma and 9 cases of minimal deviation adenocarcinoma.Thirty-six cases of squamous carcinoma of the cervix were chosen as controls.Results①The detection rate of HPV16/18 in minimal deviation adenocarcinoma was lower than that of the other cases(P＜0.05)，but there was no significant difference between endocervical adenocarcinoma，endometrioid adenocarcinoma and squamous carcinoma(P＞0.05).②The positive rate of P16 in minimal deviation adenocarcinoma was lower than that of the other cases(P＜0.05).③The positive expression of P16 in all HPV-positive cases was significantly higher than that in all HPV-negative cases.Positive expression of P16 was related to HPV16/18 infection(P＜0.05).Conclusion①The occurrence of endocervical adenocarcinoma and endometrioid adenocarcinoma of cervix are related to the infection of HPV16/18，but perhaps not for minimal deviation adenocarcinoma.②Overexpression of P16 may play an important role in the occurrence and development of some usual adenocarcinoma of cervix，but perhaps not in minimal deviation adenocarcinoma.③Overexpression of P16 is closely related to the infection of HPV16/18.

cervical adenocarcinoma;minimal deviation adenocarcinoma;HPV16/18;P16

R737.33

A

1007 －6611(2011)01 －0046 －04

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.01.012

張玲，女，1980－10生，碩士，講師，E-mail:zhanglingty@sohu.com.

2010－09－27］