急性肺栓塞大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)及功能變化

劉春萍， 崔俊玉， 陳杭薇， 陶 然， 張力華， 陸慰萱 (北京軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科， 北京 00700;

2北京軍區(qū)總醫(yī)院呼吸科;3北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍心理衛(wèi)生指導(dǎo)中心;4盤錦市第四人民醫(yī)院護(hù)理部;5北京協(xié)和醫(yī)院呼吸科;*通訊作者，E-mail:liuchunpingcn@yahoo.com.cn)

急性肺栓塞大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)及功能變化

劉春萍1*， 崔俊玉1， 陳杭薇2， 陶 然3， 張力華4， 陸慰萱5(1北京軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科， 北京 100700;

2北京軍區(qū)總醫(yī)院呼吸科;3北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍心理衛(wèi)生指導(dǎo)中心;4盤錦市第四人民醫(yī)院護(hù)理部;5北京協(xié)和醫(yī)院呼吸科;*通訊作者，E-mail:liuchunpingcn@yahoo.com.cn)

目的 探討急性肺栓塞大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞功能及形態(tài)的變化。 方法 16只雄性SD大鼠以隨機數(shù)字表法隨機分為對照組、栓塞組，每組8只。栓塞組以明膠海綿溶液經(jīng)頸靜脈注入制備大鼠肺栓塞模型，經(jīng)右心導(dǎo)管測定肺動脈壓、心率、呼吸頻率，并行動脈血氣分析;對照組手術(shù)過程同栓塞組，頸靜脈注入同等體積生理鹽水。實驗大鼠于造模后24 h時處死，取肺組織制備病理切片，HE染色光鏡下觀察肺組織病理變化，電鏡下觀察Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;留取支氣管肺泡灌洗液(BALF)行磷脂測定，肺組織行肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(SPA)蛋白及mRNA水平測定。 結(jié)果 對照組和栓塞組大鼠肺動脈平均壓、動脈血氧分壓(單位:mmHg)比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(14.2 ±4.1vs26.1 ±7.5，P＜0.05;94.1 ±8.8vs80.5 ±5.8，P＜0.05)。對照組和栓塞組肺泡灌洗液磷脂水平分別為(374.17 ±36.55)mg/100 ml、(311.67 ±48.56)mg/100 ml(P＜0.05)。栓塞組肺組織SPA蛋白、mRNA水平均明顯低于對照組(P＜0.05)。光鏡下24 h時栓塞組大鼠肺組織可見多個血管腔有明膠海綿栓塞;電鏡下，對照組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器豐富，板層小體排列整齊，肺泡表面活性物質(zhì)層連續(xù)完整;栓塞組大鼠Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)欠規(guī)則，線粒體腫脹、嵴斷裂，板層小體空泡化，肺泡表面活性物質(zhì)層連續(xù)性中斷。 結(jié)論 急性肺栓塞后大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞功能及形態(tài)均發(fā)生明顯變化，產(chǎn)生表面活性物質(zhì)能力顯著降低，可能在肺栓塞動脈低氧血癥中起重要作用。

肺栓塞; 大鼠; Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞

肺表面活性物質(zhì)在維持肺泡穩(wěn)定性、降低肺泡表面張力方面起著決定性作用，其主要由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞合成和分泌。肺表面活性物質(zhì)由90%的磷脂和10%的肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白(SPs)組成，后者以SPA為主［1］，是磷脂降低肺表面張力的必需成分。本研究的目的是了解急性肺栓塞時肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞功能及形態(tài)學(xué)改變。

1 材料及方法

1.1 方法 雄性SD大鼠16只，體重230－260 g(由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所提供)按隨機數(shù)字表法隨機分為對照組和實驗組，每組8只。實驗組以明膠海綿溶液制備大鼠肺栓塞模型［1］。所有大鼠均在制作模型后24 h時處死。

1.2 實驗數(shù)據(jù)的采集及標(biāo)本處理 上述動物處死前以模型制備時相同的麻醉方法麻醉。

1.2.1 大鼠生理指標(biāo)測定及病理檢查 用聚苯乙烯管經(jīng)右頸外靜脈插管測定肺動脈壓、心率和呼吸頻率;經(jīng)頸動脈插管取血行動脈血氣分析;取肺左葉置4%多聚甲醛溶液中固定48 h以上，石蠟包埋切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，剪一小塊肺組織(約2－3 mm)置2%戊二醛中固定，行透射電鏡(日本JEOL公司JEM1010)檢查。

1.2.2 大鼠肺泡灌洗液磷脂測定 采用消化法。先用氯仿甲醇混合液提取磷脂，然后用硫酸－過氯酸消化提取液中的有機物，再加入鉬酸鹽，然后用還原劑抗壞血酸使磷鉬酸還原產(chǎn)生鉬蘭，分光光度計比色、測定脂性磷的含量，卵磷脂分子中磷約占4%，故脂性磷換算成磷脂的因數(shù)一般用25。

1.2.3 大鼠肺組織SPA蛋白及mRNA檢測 主要試劑及儀器:羊抗人SPA多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);兔抗羊二抗(北京中山試劑公司)。TGL-16G低溫高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);BIO-RAD 450型酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)。實驗中一抗?jié)舛?∶200，二抗?jié)舛?∶3 000。

1.2.3.1 免疫印跡法檢測肺組織SPA蛋白表達(dá)

用蛋白裂解液提取肺組織蛋白并測濃度，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。PVDF膜用封閉液(脫脂奶粉溶于0.1%TBST(Tween-20 Tris緩沖液)中，終濃度5%)封閉4℃過夜，一抗4℃過夜，TBST漂洗PVDF膜3次，每次10 min，再加二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。將化學(xué)發(fā)光劑、增強劑按1∶1比例配成應(yīng)用液滴于膜上，共育5 min后暗室曝光2 min，取出沖洗，結(jié)果掃描入計算機，用Quantity One軟件進(jìn)行分析。以對照組條帶灰度定為基礎(chǔ)值，各組條帶灰度值與其之比作為SPA相對值。

1.2.3.2 SPA mRNA的提取及檢測 提取肺組織總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴增SPA目的片段，引物序列(上海生工生物技術(shù)公司代理合成):SPA上游引物，5'－GGAAGCCCTGGGATCCCTGGA －3'，下游引物，5'－ TGGGTACCAGTTGGTGTAGT－3'，擴增片段長度539 bp;3－磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上 游 引 物，5'－ACCATCTTCCAGGAGCGAGATC－3'，下游引物，5'－GCCATCCACAGTCTTCTGAGT－3'，擴增片段長度348 bp。先合成cDNA第1鏈，然后行PCR反應(yīng):在PCR反應(yīng)管中依次加入無菌水 34.5 μl、cDNA 3.0 μl、10 × PCR buffer 5 μl、dNTPs(每種 0.25 μl，濃度 mmol/L)1.0 μl、上下游引物各3.0 μl(終濃度 0.5 μmol/L)，混勻后稍離心，置95℃ 5 min后立即冰浴;加0.5 μl DNA聚合酶混勻離心，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)28次后72℃延伸10 min。分別取SPA擴增產(chǎn)物10 μl與等量GAPDH擴增產(chǎn)物混合，加10×加樣緩沖液4 μl，于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用UVI凝膠圖像掃描儀分析，比較每個樣本SPA DNA與相應(yīng)GAPDH DNA擴增條帶光密度，其比值作為SPA mRNA水平的相對值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究結(jié)果采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，實驗結(jié)果比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠呼吸生理指標(biāo)及動脈血氣分析結(jié)果 與對照組比較，栓塞組大鼠肺栓塞后24 h肺動脈平均壓顯著升高、動脈血PO2顯著下降，心率、呼吸頻率、動脈血PCO2、pH變化不明顯，見表1。

2.2 大鼠肺組織病理及電鏡觀察結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下，正常組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)排列整齊(圖1A);栓塞組大鼠多個肺動脈腔內(nèi)有海綿明膠栓塞，其中網(wǎng)羅有紅、白細(xì)胞，纖維蛋白等，可見繼發(fā)紅血栓形成(圖1B)。所有肺栓塞后大鼠肺組織均有不同程度充血、水腫，肺泡間隔增厚，炎性細(xì)胞浸潤明顯，肺泡腔內(nèi)巨噬細(xì)胞明顯增多。電鏡下，對照組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器豐富，板層小體排列整齊;肺泡表面活性物質(zhì)層連續(xù)完整(圖2A);肺栓塞后大鼠Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)欠規(guī)則，線立體腫脹、嵴斷裂，板層小體空泡化，肺泡表面活性物質(zhì)層連續(xù)性中斷(圖2B)。

表12組大鼠肺動脈壓、心率、呼吸頻率、動脈血氣分析結(jié)果及比較(±s，n=8)Tab 1 Comparison of pulmonary artery pressure，heart rate，respiratory rate and blood gas analysis between 2 groups(±s，n=8)

表12組大鼠肺動脈壓、心率、呼吸頻率、動脈血氣分析結(jié)果及比較(±s，n=8)Tab 1 Comparison of pulmonary artery pressure，heart rate，respiratory rate and blood gas analysis between 2 groups(±s，n=8)

組別 肺動脈壓/mmHg 心率(次/min) 呼吸(次/min) PaO2/mmHg PaCO2/mmHg對照組 14.2 ±4.1 415.0 ±15.2 81.0 ±1.7 94.1 ±8.8 43.9 ±2.8栓塞組 26.1 ±7.5 451.4 ±34.8 80.6 ±2.5 80.5 ±5.8 42.5 ±3.2 t值 3.60 1.33 1.46 2.98 2.05 P值0.04 0.05 0.30 0.04 0.28

圖1 光鏡下大鼠肺組織病理變化(HE，×100)Fig 1 Pathological changes of lung tissues under microscope(HE，×100)

圖2 電鏡下大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)(×8 000)Fig 2 Morphology of typeⅡ pneumonocytes in rats under electromicroscope(×8 000)

2.3 大鼠BALF磷脂、肺組織SPA mRNA及蛋白表達(dá)水平變化 與對照組比較，栓塞組大鼠BALF磷脂(mg/100 ml)水平顯著下降，肺組織SPA mRNA(SPA/GADPH)、SPA蛋白(SPA/C)表達(dá)均顯著降低(P＜0.05，見表2)。

表22組大鼠BALF磷脂、肺組織SPA mRNA及蛋白表達(dá)水平比較(±s)Tab 2Comparison of phospholipid in BALF，expression of SPA mRNA and protein in lung tissue between 2 groups(±s)

表22組大鼠BALF磷脂、肺組織SPA mRNA及蛋白表達(dá)水平比較(±s)Tab 2Comparison of phospholipid in BALF，expression of SPA mRNA and protein in lung tissue between 2 groups(±s)

組別 n 磷脂/(mg/100 ml) SPA mRNA SPA 蛋白對照組374.17 ±36.55 1.43 ±0.51 1.00 ±0.00栓塞組 8 311.67 ±48.56 0.83 ±0.33 0.44 ±0.18 t值 4.30 2.61 2.06 P值80.03 0.04 0.03

3 討論

肺表面活性物質(zhì)是由磷脂和特異性蛋白組成的復(fù)合物，在降低肺泡氣液面表面張力、維持肺泡穩(wěn)定性方面起著重要作用。肺表面活性物質(zhì)是在肺泡Ⅱ型細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)合成，通過高爾基復(fù)合體轉(zhuǎn)運到板層小體中貯存，然后經(jīng)胞吐作用分泌到肺泡腔，轉(zhuǎn)變?yōu)楣軤钏枇字罱K在SPs作用下形成吸附在肺泡表面的分子膜，發(fā)揮生理功能［2］。因此，Ⅱ型上皮細(xì)胞功能正常在維持肺泡張力中至關(guān)重要，同時，肺表面活性物質(zhì)的變化也可反映Ⅱ型上皮細(xì)胞功能的改變。

既往國外學(xué)者曾通過結(jié)扎動物肺動脈的方法觀察肺動脈血流阻斷后肺表面張力和表面活性磷脂的變化。結(jié)果顯示，急性肺栓塞后有肺栓塞區(qū)域肺最小表面張力的升高及肺表面活性磷脂合成的減少，從而可導(dǎo)致肺不張［3，4］。Wilson 等［5］曾研究了 21例既往沒有心肺疾患的急性肺栓塞患者低氧血癥的原因，發(fā)現(xiàn)幾乎所有患者的低氧血癥都可用“分流樣”效應(yīng)解釋。他們推測肺栓塞后由于血流的部分或完全中斷，引起肺表面活性物質(zhì)的改變，造成肺不張;或因為梗死區(qū)發(fā)生自發(fā)性纖溶和再通，自發(fā)性纖溶清除栓子的速度快于局部肺泡表面活性物質(zhì)恢復(fù)的速度，因而也會造成肺不張及分流。以上研究均支持肺泡表面活性物質(zhì)減少所致肺不張、肺內(nèi)分流引起急性肺栓塞呼吸困難機制。

盡管Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞在肺表面活性物質(zhì)代謝中的作用至關(guān)重要，但尚沒有文獻(xiàn)報道急性肺栓塞情況下Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的變化。在此基礎(chǔ)上，本研究觀察了急性肺栓塞大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞功能及形態(tài)的改變。本研究結(jié)果顯示，急性肺栓塞后24 h大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，線粒體腫脹、嵴斷裂，板層小體空泡化，肺泡表面活性物質(zhì)層連續(xù)性中斷，同時其功能也發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為BALF中總磷脂與肺組織SPA mRNA及蛋白一致性下降，說明急性肺栓塞時Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)及功能均發(fā)生明顯變化，導(dǎo)致肺表面活性物質(zhì)明顯減少。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞變化的主要原因考慮是由于肺動脈栓塞、肺組織血流中斷導(dǎo)致Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞缺血、缺氧，功能下降或消失所致。當(dāng)然，肺表面活性物質(zhì)的減少還可能存在其他原因，如滅活增加、巨噬細(xì)胞吞噬增加以及消耗增加等［5，6］，但Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞功能損傷所致肺表面活性物質(zhì)的產(chǎn)生減少可能在肺栓塞動脈低氧血癥、呼吸困難發(fā)生中起更為重要的作用。

本研究結(jié)果提示，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)及功能改變在急性肺栓塞病理生理中起著重要作用。

［1］ 劉春萍，吳郡，劉偉國，等.急性肺栓塞大鼠血清血管緊張素轉(zhuǎn)換酶I的變化［J］.中華老年心腦血管病雜志，2007，9(10):700－702.

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Morphological and functional changes of typeⅡpneumonocytes in rats after acute pulmonary embolism

LIU Chun-ping1*，CUI Jun-yu1，CHEN Hang-wei2，TAO Ran3，ZHANG Li-hua4，LU Wei-xuan5(1Dept of Cardiovascular Disease，Military General Hospital of Beijing PLA，Beijing 100700，China;2Dept of Respiratory，Military General Hospital of Beijing PLA;3Mental Health Center，Military General Hospital of Beijing PLA;4Forth People’s Hospital of Panjing City;5Dept of Respiratory，Peking Union Hospital;*Corresponding author，E-mail:liuchunpingcn@yahoo.com.cn)

ObjectiveTo explore the changes of morphology and function of typeⅡpneumonocytes in rats with acute pulmonary embolism.MethodsSixteen male SD rats were randomized into control group(n=8)and embolism group(n=8).The rats were injected with medical gelfoam microspheres via jugular vein to induce PE model in embolism group，while in control group the rats were injected with saline instead of gelfoam granule solution.They were sacrificed at 24 h after establishing PE model.Pulmonary artery pressure，heart rate and respiratory rate were detected by right heart catheterization and artery blood gas was analyzed at 24 h.Bronchoalveolar lavage fluid(BALF)was collected for detecting the levels of phospholipid.Lung tissue was dyed with HE and the morphology of typeⅡ pneumonocytes was observed under electric microscope.RT-PCR and Western blot were used to study the expression of SPA mRNA and SPA protein in lung tissues.ResultsThe mean pulmonary pressure and artery oxygen blood pressure were significantly different between control group and embolism group［(14.2 ±4.1)mmHgvs(26.1 ±7.52)mmHg，P＜0.05;(94.1 ±8.8)mmHgvs(80.5 ±5.8)mmHg，P＜0.05］.The levels of phospholipid in BALF were(374.17 ±36.55)mg/100 ml and 311.67 ± 48.56)mg/100 ml in control group and embolism group，respectively(P＜0.05).The expression of SPA mRNA and protein was significantly lower in embolism group than in control group(0.83 ±0.33vs1.43 ±0.51，P＜0.05;0.44 ±0.18vs1.00 ±0.00，P＜0.05).At 24 h，pulmonary arteries were seen emboliation with gelfoam under microscope.The microvillus of type Ⅱ pneumocytes reduced and desquamated under eletromicroscope，the mitochondria was bulged with fractured ridge and irregular empty lamina bodies，and the continuity of surfactant layer was interrupted.ConclusionThe morphology and function of typeⅡpneumonocytes are changed significantly in acute pulmonary embolism rats，with decreased production of surfactant，which may play an important role in hypoxemia of pulmonary embolism.

pulmonary embolism;rats;typeⅡpneumonocyte

R563.5

A

1007 －6611(2011)01 －0029 －04

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.01.008

劉春萍，女，1967－11生，博士，副主任醫(yī)師.

2010－10－18］