雙波長比例法測定單細胞活性氧探析

趙成瑞， 崔香麗， 吳博威 (山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院生理教研室， 汾陽 0300;山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系;通訊作者，Tel:0358 －733，E-mail:zhaochengruizcr@63.com)

雙波長比例法測定單細胞活性氧探析

趙成瑞1*， 崔香麗2， 吳博威2(1山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院生理教研室， 汾陽 032200;2山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系;*通訊作者，Tel:0358 －7231312，E-mail:zhaochengruizcr@163.com)

目的 建立雙波長比例法測定單細胞活性氧的方法。 方法 ①酶法急性分離成年大鼠心室肌細胞，用離子影像系統(tǒng)測定熒光信號，確定熒光強度值變化相反的兩個激發(fā)光波長。②BPS-4裝置灌流心肌細胞，模擬心肌缺血/再灌注模型及再灌注時應(yīng)用還原型谷胱甘肽，用雙波長比例法測定細胞內(nèi)活性氧含量變化，驗證此法。 結(jié)果 ①熒光強度值最大和最小的激發(fā)光波長分別是:480 nm和420 nm，以F480/F420的比值表示活性氧的含量。②心室肌細胞在模擬缺血期和恢復(fù)再灌注期的相對F480/F420分別為缺血前的(115.27±4.52)%和(116.99±3.99)%，在再灌注期給予GSH，則活性氧含量降為缺血前的(101.14±3.20)%。 結(jié)論 雙波長比例法可用于測定細胞內(nèi)活性氧。

活性氧; 缺血再灌注; 還原型谷胱甘肽

活性氧是化學(xué)性質(zhì)較活潑的含氧代謝物質(zhì)，反應(yīng)性強、壽命短，難檢測［1，2］，因此研究其檢測方法尤為重要。生物學(xué)、醫(yī)學(xué)最先研究活性氧的方法有脈沖射解、順磁共振和自旋搜集技術(shù)，利用化學(xué)熒光指示劑二氯二氫熒光素乙酸酯(2'，7'－dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)，設(shè)定激發(fā)波長為 480 nm左右，發(fā)射波長為510 nm，用測得的DCF熒光信號來間接反映活性氧含量，是一種單波長法［3－6］。這些方法所需儀器昂貴，不適于普及，且所測結(jié)果受染料導(dǎo)入細胞內(nèi)的濃度、細胞厚度、光褪色和染料漏出胞外等因素影響而不準確，特建立雙波長比例法，利用離子影像系統(tǒng)，測定細胞內(nèi)的活性氧。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要儀器 膠原酶P、化學(xué)熒光染料DCFH-DA、二甲基亞砜、?；撬帷－谷氨酸、還原型谷胱甘肽、N－2－羥乙基哌嗪－N'－2－乙烷磺酸、乙二醇(2－氨基乙醚)四乙酸為Sigma公司產(chǎn)品;其余均為國產(chǎn)分析純試劑。離子影像分析系統(tǒng)為德國Tillphotonics公司產(chǎn)品;BPS-4灌流裝置為美國Ala Scientific Instruments Inc公司產(chǎn)品;倒置熒光顯微鏡為德國Zeiss公司產(chǎn)品。

1.2 動物來源 Wistar大鼠，體重280－300 g，雌雄不拘，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 確定熒光強度值變化相反的兩個波長 酶法急性分離單個大鼠心室肌細胞。復(fù)鈣、負載染料DCFH-DA、選取結(jié)構(gòu)良好的細胞用10 mmol/L的雙氧水進行灌流。設(shè)置激發(fā)光波長從340 nm到580 nm，以20 nm波長的間隔遞增，對細胞進行掃描，記錄熒光光譜曲線及每個波長下的熒光強度值，發(fā)射光波長固定為510 nm，確定熒光強度值變化相反的兩個波長。

1.3.2 心肌細胞內(nèi)活性氧含量的測定 酶法急性分離單個大鼠心室肌細胞。復(fù)鈣、負載染料DCFHDA、選取結(jié)構(gòu)良好的細胞進行實驗。設(shè)置激發(fā)光波長分別為480 nm和420 nm，系統(tǒng)發(fā)射光的波長定為510 nm。離子影像系統(tǒng)依次采集激發(fā)光為480 nm和420 nm的成對系列圖像，并從同一對系列圖像計算出的熒光比值F480/F420，細胞內(nèi)活性氧水平以F480/F420表示。并計算出相對于正常(缺血前)的相對熒光密度，以表示細胞內(nèi)活性氧的變化，結(jié)果以相對熒光密度表示(100%)。

1.3.3 心肌細胞模擬缺血再灌注模型的建立 利用BPS-4裝置對心肌細胞進行灌流。在對心肌細胞進行灌流以前，盛有缺血臺式液的容器被封閉，并通過特制旁口持續(xù)充以100%的氮氣40 min。心肌細胞模擬缺血:將心肌細胞置于特制灌流槽內(nèi)，用模擬缺血臺氏液，對心肌細胞進行灌流，并通過灌流槽特制側(cè)孔在灌流槽的上方持續(xù)充以100%氮氣，在灌流槽上方置以載玻片，使灌流槽形成一密閉腔。心肌細胞模擬再灌注:灌以正常臺氏液，停止充氮氣，并開放灌流槽。在實驗中監(jiān)測灌流液氧分壓，以模擬缺血后氧分壓為55－60 mmHg為模型成功。

1.3.4 心肌細胞再灌注時抗氧化劑的應(yīng)用 心肌細胞模擬缺血后，利用BPS-4裝置對心肌細胞以含有0.8 mmol/L還原型谷胱甘肽(GSH)的臺氏液進行灌流。

1.3.5 實驗分組 心肌細胞被隨機分為3組:正常臺氏液灌注組(control group):心肌細胞給予30 min正常臺氏液灌注;模擬缺血/再灌注組(I/R group):心肌細胞先給予2 min正常臺氏液灌注，之后給予20 min模擬缺血和8 min模擬再灌注;抗氧化劑保護組(GSH group):心肌細胞先給予2 min正常臺氏液灌注，之后給予20 min模擬缺血和8 min的含GSH的臺氏液再灌注。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示。采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，兩組間比較用t檢驗，以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 通過對選取細胞進行實驗后記錄的熒光光譜曲線，以及每個激發(fā)光波長下的熒光強度值進行分析發(fā)現(xiàn)，熒光信號強度值變化相反的兩個激發(fā)光波長分別是480 nm和420 nm，在480 nm時熒光信號強度值最大，在420 nm時熒光信號強度值最小(見圖1)，并且在實驗的細胞所得結(jié)果都一致和穩(wěn)定。所以確定這兩個波長作為用雙波長比例測量法測定單細胞活性氧的兩個激發(fā)光波長，以F480/F420的形式表示細胞內(nèi)的活性氧。

圖1 各個激發(fā)光波長下的熒光強度值Fig 1 The fluorescence intensities at different excitation wavelengths

2.2 正常臺氏液灌注時，細胞內(nèi)熒光強度比值(F480/F420)相對穩(wěn)定(見圖2);模擬缺血后，細胞熒光強度比值迅速增加，在缺血末20 min時相對熒光密度為(115.27±4.52)%;再灌注后，心肌細胞的熒光強度比值在2 min內(nèi)出現(xiàn)高峰，之后輕度降低維持在相對較高的水平，相對熒光密度為(116.99±3.99)%(見表1，圖3);若再灌注時加入 0.8 mmol/L還原型谷胱甘肽，細胞熒光強度比值迅速下降，相對熒光密度為(101.14 ±3.20)%(見表1，圖4)。

圖2 正常臺式液灌注組心肌細胞內(nèi)熒光強度比值Fig 2 The fluorescence intensities of intracellular ROS in cardiomyocytes in control group

表1 模擬缺血再灌注與用GSH心肌細胞相對熒光密度比較(%)Tab 1 Comparison of relative fluorescene intensities of intracellular ROS in cardiomyocytesin I/R group and GSH group (%)

與 control組比較，△P ＜0.05;與 I/R 組比較，#P ＜0.05

圖3 模擬缺血再灌注組心肌細胞內(nèi)熒光強度比值Fig 3 The fluorescence intensities of intracellular ROS in cardiomyocytes in I/R group

圖4 模擬缺血后用GSH組心肌細胞內(nèi)熒光強度比值Fig 4 The fluorescence intensities of intracellular ROS in cardiomyocytes in GSH group

3 討論

利用離子影像系統(tǒng)建立雙波長比例法測定心肌細胞內(nèi)的活性氧。在實驗中發(fā)現(xiàn)，激發(fā)光波長為480 nm時，所得到的DCF熒光信號強度值最大，這與目前已知的用激光共聚焦掃描顯微鏡、流式細胞儀等儀器使用480 nm的激發(fā)光波長測定細胞內(nèi)的活性氧相一致［7，8］。實驗中檢測到的420 nm的激發(fā)光波長時所得的熒光信號強度值最小，所以確定這兩個激發(fā)光波長，建立雙波長比例測量法。模擬缺血再灌注模型，用此法檢測細胞內(nèi)活性氧的變化，與已知的缺血再灌注發(fā)生中活性氧的變化情況進行對比，驗證此法的可行性［9］。

雙波長比例測量法檢測細胞內(nèi)的活性氧，缺血期心肌細胞內(nèi)活性氧含量升高，在再灌注剛開始2 min內(nèi)，活性氧含量迅速升高，產(chǎn)生一個峰值，后下降，但是仍然保持較高水平，和缺血期間沒有明顯差異。再灌注時，加還原型谷胱甘肽后心肌細胞內(nèi)的活性氧含量明顯下降至接近于正常水平，與電子自旋共振技術(shù)直接測定活性氧的結(jié)果是一致的［10］，說明了這種方法可以用來檢測心肌細胞內(nèi)的活性氧。

雙波長比例法具有以下明顯優(yōu)于單波長法的優(yōu)點:不受染料導(dǎo)入細胞內(nèi)的濃度、細胞厚度、光褪色和染料漏出胞外等影響，所測結(jié)果以比值的形式來表示，消除了背景熒光強度的干擾，更加準確。這是一種簡便、易行的測定方法，建立后將有助于活性氧在有關(guān)研究領(lǐng)域的開展。當然這種方法還只是處于一種初步建立階段，更多的實驗工作、檢測指標正在進一步的完成中。

［1］ Frank J，Pompella A，Biesalski HK.Histochemical visualization of oxidant stress［J］.Free Radic Biol Med，2000，29(11):1096 －1105.

［2］ Greeberg ER，Baron JA，Tosteson TD，et al.A clinical trial of antioxidant vitamins to prevent colorectal adenoma［J］.NEJM，1994，331:141 －147.

［3］ Duranteau J，Chandel NS，Schumacker PT.Intracellular signaling by reactive oxygen species during hypoxia in cardiomyocytes［J］.Biol Chem，1998，273:11619 －11624.

［4］ Kehrer JP，Paraidathathu T.The use of fluorescent probes to assess oxidative processes in isolated-perfused rat heart tissue［J］.Free Radic Res Commun，1992，16:217 －225.

［5］ Khalid MA，Ashraf M.Direct detection of endogenous hydroxyl radical production in cultured adult cardiomyocytes during anoxia and reoxygenation.Is the hydroxyl really the most damaging radical species［J］.Circ Res，1993，72:725 － 376.

［6］ Sarvazyan N.Visualization of doxorubicin-induced oxidative stress in isolated cardiac myocytes［J］.Heart Circ Physiol，1996，271:H2079－H2085.

［7］ Fu Y，Ji LL.Chronic ginseng consumption attenuates age-associated oxidative stress in rats［J］.J Nutr，2003，133:3603 －3609.

［8］ Carter WO，Narayanan PK，Robinson JP.Intracellular hydrogen peroxide and superoxide anion detection in endothelial cells［J］.Leukoc Biol，1994，55(2):253 － 258.

［9］ Moens AL，Claeys MJ，Timmermans JP，et al.Myocardial ischemia/reperfusion injury，a clinical view on a complex pathophysiological process［J］.Cardiology，2005，100:179 － 190.

［10］ 金惠銘，王建枝.病理生理學(xué)［M］.6版.人民衛(wèi)生出版社，2004:202－203.

Double wavelengths ratio in detection of the concentrations of reactive oxygen species

ZHAO Cheng-rui1*，CUI Xiang-li2，WU Bo-wei2(1Dept of Physiology，F(xiàn)enyang College of Shanxi Medical University，F(xiàn)enyang 032200，China;2Dept of Physiology，Shanxi Medical University;*Corresponding author，Tel:0358－7231312，E-mail:zhaochengruizcr@163.com)

ObjectiveTo establish the double wavelengths ratio for detecting the concentrations of reactive oxygen species(ROS)in single cell.Methods①Adult rat cardiomyocytes were isolated by enzymatic dissociation.Fluorescence signals of the single cell were recorded by the ion imaging system for finding the two excitation wavelengths which made the biggest and the smallest fluorescence signal intensities.②Cardiomyocytes were perfused with BPS-4 to imitate the ischemia/reperfusion model.Some cardiomyocytes were reperfused with GSH.The intracellular ROS concentrations were measured.Results①The values of the fluorescence intensity at 480 nm and 420 nm were the biggest and smallest，respectively.F480/F420 was used to represent the intracellular ROS concentrations.②At mimic ischemia and reperfusion stages，intracellular ROS fluorescence intensities(F480/F420)increased progressively to(115.27 ±4.52)%and(116.99 ±3.99)%of pre-ischemia respectively.When GSH was used in reperfusion，ROS fluorescence intensity decreased quickly to(101.14 ±3.20)%of pre-ischemia.ConclusionDouble wavelengths ratio could be used to detect intracellular ROS.

reactive oxygen species;ischemia reperfusion;reduced glutathione

O657

A

1007 －6611(2011)01 －0007 －03

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.01.002

趙成瑞，女，1980－02生，碩士，助教，E-mail:zhaochengruizcr@163.com.

2010－11－01］