打頂及仿生信號分子對煙草氧化脅迫的影響

張新華，姚忠達(dá)，陳常偉，查向東，程新勝*

1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心，合肥市徽州大道1129號230052

2.安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥市肥西路3號230039

3.安徽中煙工業(yè)公司技術(shù)中心，合肥市天達(dá)路9號230088

植物在受到昆蟲傷害或其他機(jī)械性創(chuàng)傷時(shí)其組織內(nèi)可誘發(fā)大量活性氧積聚，使植株形成氧化脅迫［1］，并激活以茉莉酸（Jasmonic acid，JA）為主要信號分子的抗性反應(yīng)［2］，使碳水化合物的分配路徑、次生代謝產(chǎn)物的形成發(fā)生變化，促使大量抗生性物質(zhì)積累。打頂是煙草生產(chǎn)上一項(xiàng)提高煙葉產(chǎn)量、質(zhì)量的重要技術(shù)措施［3］，關(guān)于打頂對煙葉的影響已有大量研究［4-7］，但打頂對煙草來說也是一種機(jī)械性損傷，這種損傷對此生長時(shí)期的煙草植株產(chǎn)生氧化脅迫尚未見報(bào)道。另外，一些取食煙草的寡食性昆蟲（如煙青蟲Heliothis assulta Guenee）通過下唇腺分泌特異性酶，抑制創(chuàng)傷信號分子的積累和傳遞，從而降低其取食對煙株的刺激，減少煙堿合成與傳遞［8-9］。黃蘭等［10］選取由昆蟲下唇腺特異性酶產(chǎn)生的與創(chuàng)傷信號相頡抗的仿生型信號分子BSM（Bionics Signal Molecule），在煙草打項(xiàng)后將其涂抹在打頂煙株創(chuàng)傷端面，可以降低煙草生物堿的含量。為此，進(jìn)行了打頂后一定時(shí)期內(nèi)煙草植株的氧化脅迫反應(yīng)以及BSM對煙草這一氧化脅迫的抑制效應(yīng)研究。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試品種為白肋煙鄂煙1號（Nicotiana tabacum cv.Eyanyihao），2010年在中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)南區(qū)實(shí)驗(yàn)基地種植。采用溫室盆栽，盆高35 cm，直徑25 cm，每盆裝過篩風(fēng)干土至2/3處，施氮量為64 g/株，按N∶P∶K=1∶1.5∶2.5施用煙草專用復(fù)合肥。

1.2 儀器與試劑

756P型紫外-可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）、超聲儀（Autoscience公司）、FA1004電子天平（上海天平儀器廠）、TGL-20G高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、pHS-3C型精密pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；HH-8電熱恒溫水浴鍋（深圳國華儀器廠）、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、Olympus SP-560UZ數(shù)碼相機(jī)。

3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB，上海晶純試劑有限公司）；氮藍(lán)四唑（NBT，Sigma公司）；鹽酸羥胺（AR，上?；瘜W(xué)試劑廠）；α-萘胺（CP，上海泗聯(lián)化工廠）；對氨基苯磺酸（AR，國營上?；瘜W(xué)試劑廠）；聚乙烯毗咯烷酮（PVP，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；EDTA-Na2（CP，中國上海試劑一廠）；核黃素（BR，上?；瘜W(xué)試劑廠）；水合氯醛（AR）、硫代巴比妥酸（BR）、三氯乙酸、甲硫氨酸（BR）（中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司）。

1.3 試驗(yàn)處理

設(shè)置對照（CK）、處理1（T1，常規(guī)打頂）與處理2（T2，常規(guī)打頂＋涂抹BSM）3個(gè)處理。其中T2處理組中，BSM的濃度是1.0 mol/L，打頂后立即用中號羊毫蘸取約0.25 mL BSM涂抹于處理株傷口端面。每株煙打頂后的總留葉數(shù)為20片，每組處理均取10株煙苗分別掛牌標(biāo)記。在打頂后3，6，12，24，48 h采摘第18葉（從上至下數(shù)）測定超氧陰離子（O2-·）、過氧化氫（H2O2）含量；打頂后2，4，6，8和10 d采摘第19葉測定超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。

1.4 樣品處理與生化分析

參照王愛國等［11］的方法測定O2-·含量：在采集的煙葉上用打孔器取直徑為6 mm小圓片，稱取1 g，放入50 mL燒杯中，并加入10 mmol/L鹽酸羥胺5 mL，真空滲入10 min后，將燒杯置于30℃溫箱中溫育45 min。溫育結(jié)束后，從樣品試管中吸取2mL溶液，與1 mL 17 mmol/L對氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol/L α-萘胺混合，顯色反應(yīng)10 min。測定530 nm下樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出吸光度與O2-·含量滿足：CO2-·=（2×A530-0.0286）/0.0215。

參照文獻(xiàn)［12］對H2O2進(jìn)行活體組織化學(xué)原位檢測：取上部葉，用雙蒸水洗3次，在葉片前端葉脈兩側(cè)（避免取葉脈）剪下直徑4 cm煙葉圓片，取酸化的1 mg/mL DAB溶液15 mL，混合后反應(yīng)8 h。然后取出葉圓片，將其固定并在95%乙醇中煮沸10 min，然后取出在95%乙醇中洗滌3次，觀察葉片上枯斑并用數(shù)碼相機(jī)拍照。

丙二醛（MDA）含量分析：參照文獻(xiàn)［13］并稍作改進(jìn)，將采取葉片去葉脈，取鮮重0.5 g，置于預(yù)冷研缽中，加入2 mL 0.05 mol/L pH7.8的磷酸緩沖液和少量石英砂研磨、勻漿后，定容到10 mL刻度試管中。取5 mL于刻度試管中在16000 r/min下離心15 min，上清液即為樣品提取液，5℃下保存?zhèn)溆?。? mL試管分別加入1.5 mL粗酶液，2.5 mL，0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液，混勻物于沸水浴上加熱15 min，迅速冷卻后，再離心。取上清液測定532和600 nm波長下的吸光度值。

MDA的濃度公式：C=［（A532-A600）×A×V/a］/0.155×W

式中：A——反應(yīng)液總量；V——提取液總量；a——反應(yīng)液中的提取液數(shù)量；W——植物樣品重量。

SOD活性測定［14］：取煙草葉片（去葉脈）0.5 g于預(yù)冷的研缽中，使溶液終體積為10 mL。取4 mL于18000 r/min下離心20 min，上清液即為SOD粗提液。分別加入1.5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液，0.3 mL 130 mmol/L Met溶液，0.3 mL 750 μmol/L NBT溶液，0.3 mL 100 μmol/L EDTA-Na2液，0.3 mL 20 μmol/L核黃素0.1 mL酶液，0.5 mL蒸餾水。混勻后將1支對照管置暗處，其他各管于30℃4000 Lx日光下反應(yīng)30 min。分別測定其在560 nm處的吸光度值。已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示，計(jì)算SOD活性。

SOD總活性＝（Ack－AE）×V/（Ack×0.5×W×Vt）

式中：Ack——照光對照管的吸光度；AE——樣品管的吸光度；V——樣品液總體積（mL）；Vt——測定時(shí)樣品用量（mL）；W——樣鮮重（g）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel，Matlab7.0軟件進(jìn)行Stdev分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 打頂與BSM對白肋煙中超氧陰離子含量的影響

圖1結(jié)果表明，對照煙葉中活性氧含量在48 h內(nèi)變化基本平穩(wěn)。打頂T1處理能誘導(dǎo)植物葉片產(chǎn)生大量活性氧，以打頂后3 h的O2-·含量最高，明顯高于CK與T2處理，之后漸趨下降，在24 h后其含量快速下降，到48 h O2-·含量接近其他兩個(gè)處理。T2處理葉片中O2-·的含量一直介于CK與T1處理之間，但在檢測時(shí)間內(nèi)其變化趨勢與CK及T1不同：在3 h后仍呈上升趨勢，12 h后呈明顯下降趨勢，至48 h O2-·含量與其他兩處理接近。

2.2 打頂及BSM對白肋煙H2O2含量的影響

圖1 打頂及BSM對白肋煙O2-·含量的影響Fig.1 The effects on burley tobacco O2-·content by topping and BSM

二氨基聯(lián)苯胺（DAB，3，3′-diaminobenzidine）在H2O2的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成棕褐色沉淀［15］，葉片上褐色面積與組織中H2O2含量呈正相關(guān)。圖2結(jié)果表明，在5個(gè)不同時(shí)間段的樣品中，總體上均呈現(xiàn)出T1處理的褐斑面積大或顏色最深，表明其組織中的H2O2明顯高于CK與T2處理，并以打頂后6 h的褐色沉淀斑點(diǎn)最顯著；而CK 5個(gè)時(shí)間段的樣品上，葉片中褐色沉淀斑點(diǎn)變化不明顯且斑點(diǎn)面積最少；而打頂后涂抹BSM的T2處理，在5個(gè)時(shí)間段中，除48 h外，其他時(shí)間段內(nèi)其葉片上褐色斑面積與CK差異不明顯，且5個(gè)時(shí)間段樣品上的色斑明顯小于T1處理。表明打頂后煙草的葉片組織內(nèi)迅速積累了H2O2，而涂抹BSM降低了H2O2的積聚。

2.3 打頂與BSM對白肋煙MDA含量的影響

MDA是細(xì)胞膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量代表著氧化脅迫對葉片細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層過氧化的程度［14］。從圖3可見，不打頂?shù)腃K，從第2天至第10天葉片中MDA含量稍有增加但變化平緩；T1處理中的MDA高于CK與T2處理，且在2～10 d內(nèi)葉片中MDA含量變化不明顯；T2處理中，在第2天的MDA含量最高，大大高于CK但仍低于T1處理，且隨著時(shí)間的推移呈明顯下降趨勢，至第10天時(shí)，MDA含量達(dá)到最低?？傮w來看，打頂使煙株組織細(xì)胞膜發(fā)生了過氧化反應(yīng)形成了MDA的積累，但BSM處理能顯著降低葉片中MDA的含量。

圖2 不同處理對白肋煙H2O2含量的影響Fig.2 The effects on burley tobacco H2O2content by different treatment

圖3 不同處理中白肋煙中MDA的變化Fig.3 The effects on burley tobacco MDA content by different treatment

2.4 打頂與BSM對白肋煙SOD活性的影響

由圖4可見，在不打頂條件下，測定不同時(shí)間段內(nèi)白肋煙葉片中SOD活性變化不明顯；而T1處理中，打頂引起了煙葉中SOD活性的明顯變化，在打頂后第4天，與CK和T2處理相比，T1處理的SOD活性明顯降低，隨著時(shí)間的推移，T1處理葉片中SOD活性逐漸上升，到第10天，與CK和T2處理基本一致；但打頂后涂抹BSM較大幅度地提高了煙葉中SOD活性，T2處理與CK的煙葉SOD活性基本相近。

圖4 不同處理白肋煙SOD活性的變化Fig.4 The effects on burley tobaccoSOD activity different treatment

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，煙株打頂會導(dǎo)致煙草葉片在打頂后一段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生并積累超氧自由基（O2-·），H2O2，其組織中SOD酶活性降低，同時(shí)MDA含量增加，說明煙草打頂這一機(jī)械損傷能使煙草植株形成氧化脅迫并且導(dǎo)致葉片細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層發(fā)生過氧化反應(yīng)；源于昆蟲下唇腺特異性酶的BSM可以大幅度提高SOD活性，降低O2-·，·OH和H2O2含量，并且BSM還減少了MDA的含量，說明BSM可緩解打頂對煙草葉片的氧化脅迫。

內(nèi)源茉莉酸可激活煙堿合成關(guān)鍵性酶－腐胺N－甲基轉(zhuǎn)移酶（Putrescine N-methyltransferase PMT）基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)煙草生物堿的合成［16］。而JA這一信號分子是由亞麻酸起始的十八烷酸途徑在植物體內(nèi)合成的［17］，即植物在發(fā)生過氧化脅迫、細(xì)胞膜發(fā)生過氧化后α－亞麻酸被釋放，在質(zhì)體中經(jīng)脂氧合酶（LOX）、丙二烯氧合酶（AOS）和環(huán)化酶（AOC）的催化生成12－氧－植物二烯酸（12-O-PDA）進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，在過氧化物體中經(jīng)3次β－氧化形成JA［18］。在打頂后涂抹BSM使煙草葉片中生物堿含量下降，正是由于BSM在信號傳導(dǎo)的上游通過抑制煙草植株的氧化脅迫，減少了煙草植物體內(nèi)JA的合成，從而導(dǎo)致煙葉煙堿含量的降低。

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