HPLC法測定煙草及煙草制品中馬來酰肼殘留

張洪非，邊照陽，唐綱嶺，胡清源

中國煙草總公司鄭州煙草研究院國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號450001

馬來酰肼（MH）又稱抑芽丹，化學(xué)名6-羥基-2H-噠嗪-3-酮［1］，純品為白色結(jié)晶粉末，大鼠急性經(jīng)口LD50＞5000 mg/kg［2］，是一種煙草抑芽劑。1980年，ISO頒布了分光光度法測定煙草和煙草制品中的MH殘留量標(biāo)準(zhǔn)［3］。1991年，Yang［4］用膠束液相色譜法（MLC）測定了煙草中的MH殘留量，同時還比較了幾種前處理方法的優(yōu)缺點。1992年，Renaud等［5］采用衍生化-GC法分析了烤煙中的MH殘留量。1996年，John Lewis等［6］和1999年Dias等［7］先后采用HPLC法分析了馬鈴薯中的MH。Kubilius等［8-9］采用毛細管電泳法測定了土豆和洋蔥中的MH殘留。Cho［10］采用毛細管電泳法研究了蔬菜和水果中的MH殘留。裴明黎等［11］、楊昀等［12］采用HPLC法分別測定了馬鈴薯、煙葉和土壤中的MH，但后者方法的檢出限較高，不能滿足MH的檢測需要［13］。GB/T 19611—2004也規(guī)定采用分光光度法測定煙草和煙草制品中的MH［14］。然而，此標(biāo)準(zhǔn)前處理繁瑣，每人每天僅能分析5～7個樣品，因此，進行了本研究，目的是建立一種快速測定煙草及煙草制品中馬來酰肼殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1200效液相色譜儀（美國Agilent公司），配置VWD紫外檢測器；Milli-Q50超純水處理儀（美國Millipoer公司）；PHS-3C型精密pH計（上海雷磁儀器廠）；ZNHW電加熱套（河南豫華儀器有限公司）；Suplco C18固相萃取小柱（美國Suplco公司）；AE 163電子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler公司）。

馬來酰肼（97.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；冰乙酸、醋酸銨（HPLC級，美國Tedia公司）；超純水（電阻率18 MΩ·cm）；2009年進口津巴布韋烤煙煙葉L1MF樣品（2009年國家局煙草農(nóng)藥殘留普查分析樣品）。

1.2 樣品處理與分析

準(zhǔn)確稱取5.00 g 40目煙末，置于250 mL磨口圓底燒瓶中，加入50 mL 4 mol/L鹽酸，將圓底燒瓶放入電加熱套中加熱回流1 h，待回流完畢，冷卻至室溫，過濾，用4 mol/L鹽酸淋洗冷凝管和萃取過的煙末，合并濾液和淋洗液至100 mL容量瓶中，用4 mol/L鹽酸定容。準(zhǔn)確移取2 mL煙末處理液，傾入預(yù)處理（依次用2 mL甲醇和2 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉水溶液淋洗）過的C18固相萃取小柱中，接收流出液，用2 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉水溶液洗脫［6］，收集洗脫液，合并流出液和洗脫液，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液定容至5 mL，過0.45 μm水相濾膜，濾液取樣進行HPLC分析。采用比較標(biāo)樣保留時間法定性，采用外標(biāo)法定量。分析條件為：

色譜柱：Varian Microsorb-MV 100-5 C18（250 mm×4.6 mm）柱；流動相：0.1 mol/L（pH4.8）醋酸水溶液；等度洗脫；流速：0.7 mL/min；檢測波長：313 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取溶劑和萃取方式的選擇

為選擇適宜的萃取溶劑，考察了甲醇、酸化甲醇（100體積80%甲醇＋1體積4 mol/L鹽酸），以及1，2，3，4，5，6和7 mol/L鹽酸作萃取溶劑［11-13］時MH的回收率，結(jié)果甲醇、酸化甲醇和1，2，3，4，5，6和7 mol/L鹽酸的萃取回收率分別為45.68%，54.23%，77.58%，85.64%，89.92%，94.02%，93.69%，93.54%和92.87%。由此可以看出，當(dāng)鹽酸濃度為4 mol/L時萃取回收率達到穩(wěn)定，隨著鹽酸濃度的升高，回收率并沒有明顯的升高；不同濃度鹽酸的回收率均高于甲醇和酸化甲醇，可能是因為MH在煙葉中主要以自由態(tài)和結(jié)合態(tài)存在［4］，而甲醇只能提取煙葉中自由態(tài)的MH，酸化甲醇能提取煙葉中自由態(tài)和部分結(jié)合態(tài)的MH，而鹽酸溶液則能使煙葉中結(jié)合態(tài)的MH水解，從而提高了回收率。因此，選用4 mol/L鹽酸作為MH的萃取溶劑。

MH的萃取方式有超聲和加熱回流2種方式［4，11］，為了提高煙葉中MH的萃取效率，以4 mol/L鹽酸作萃取溶劑，考察了振蕩、超聲、微波和加熱回流萃取的回收率。結(jié)果表明，振蕩、超聲法、微波和加熱回流萃取的回收率分別為25.12%，30.52%，38.17%和94.02%；這表明振蕩、超聲和微波法不能有效地萃取樣品中的MH，而加熱回流的萃取方式則可以有效地萃取樣品中殘留的MH。

同理，考察了不同萃取溫度和萃取時間對萃取回收率的影響，結(jié)果見表1。從表1可以看出，180℃下萃取1 h的萃取回收率較高，且重復(fù)性較好。故選擇180℃下萃取1 h。

2.2 固相萃取小柱的選擇

分別考察了Suplco，Agilent，Waters和AgelaC18固相萃取小柱［4，11］對樣品萃取液的凈化效果及其固相萃取的回收率，結(jié)果Suplco，Agilent，Waters和Agela C18固相萃取小柱的回收率分別為96.34%，60.48%，66.21%和65.24%。由此可以看出，在考察的4種固相萃取小柱中，Suplco C18小柱的回收率最高，可以滿足在對樣品凈化的同時而不吸附目標(biāo)物的效果。因此，選擇Suplco C18小柱作固相萃取凈化柱。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 檢測波長

對文獻［6-7，11-12］中報道的檢測波長205，220，236，313 nm進行了比較，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，當(dāng)檢測波長為313 nm時響應(yīng)最高。因此，選擇檢測波長313 nm。

2.3.2 色譜柱

為達到較好的分離效果，分別考察了Eclipse XDS C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），Eclipse XDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agela XDB C1（84.6 mm×250 mm，5 μm），Varian Omnispher C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Varian Microsorb-MV 100-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱作色譜柱的分離效率，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，在以0.1 mol/L（pH4.8）醋酸水溶液作流動相條件下，唯有Varian Microsorb-MV 100-5 C18柱可以將MH和雜質(zhì)峰有效分離，從而實現(xiàn)對MH的定性和定量分析。因此，選擇Varian Microsorb-MV 100-5 C18柱作分離MH的色譜柱，在此條件下，MH的保留時間為7.789 min。

圖1 不同波長下MH響應(yīng)

2.3.3 流動相

為選擇適宜的流動相，以Varian Microsorb-MV 100-5 C18柱作色譜柱，分別考察了乙腈∶水（體積比10∶90）［11］、甲醇∶水（體積比10∶90，pH2.7）［11］、甲醇∶水（體積比3∶97，pH2.7）［12］和0.1 mol/L（pH4.8）醋酸水溶液［6］作流動相煙草樣品液中MH的分離情況，結(jié)果如圖3所示。由此可見，前3種流動相，MH的峰均不能與雜質(zhì)峰基線分離，0.1 mol/L醋酸水溶液作流動相可以使MH峰和雜質(zhì)峰達到基線有效分離，可以準(zhǔn)確定性定量；因此，選擇0.1 mol/L醋酸水溶液作流動相。

2.4 工作曲線、檢出限、定量限、回收率和重復(fù)性

準(zhǔn)確稱取0.0100 g MH標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，用超純水溶解、定容，得100 μg/mL MH標(biāo)準(zhǔn)儲備液；移取0.01，0.02，0.05，0.1，0.5，1.0，4.0和8.0 mL MH標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別置于10 mL容量瓶中，用超純水稀釋定容，得0.1，0.2，0.5，1.0，5.0，10.0，40.0和80.0 μg/mL濃度的MH標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按濃度由低至高的順序分別對MH標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行HPLC分析，并以MH的峰面積對其相應(yīng)濃度進行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性方程為Y=20.128X-0.07，相關(guān)系數(shù)1.000。以3倍信噪比計算檢出限，10倍信噪比計算定量限，則方法的檢出限為0.33 μg/g，定量限為1.0 μg/g。

在不含MH的樣品中分別加入8，80和160 μg/g 3個濃度水平MH標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個水平加標(biāo)6次，而后采用本方法測定其MH含量，并根據(jù)MH加標(biāo)量和測定量計算其回收率，結(jié)果見表2。由此可以看出，在不同添加濃度下MH的回收率在96.64%～98.02%之間，RSD在5.16%～9.35%之間，說明本方法的準(zhǔn)確性較高，重復(fù)性較好，可以滿足農(nóng)藥殘留分析的要求［13］。

圖2 煙草樣品處理液5根柱子的分離色譜圖

表2 不同濃度MH加標(biāo)回收率和重復(fù)性（n=6）

圖3 煙草樣品處理液4種流動相的MH分離色譜圖

2.5 與國標(biāo)方法測定結(jié)果比較

采用本方法和GB/T 19611—2004規(guī)定的紫外分光光度法測定了2007年煙草農(nóng)殘普查中檢出MH的23個樣品中的MH殘留量，結(jié)果見表3。對表3中數(shù)據(jù)作配對t檢驗，在置信水平95%時，顯著性水平為0.05，概率P＝0.000，小于0.05，拒絕零假設(shè)，可以認(rèn)為本法測定的結(jié)果與國標(biāo)法測定結(jié)果較為一致，二者不存在顯著性差異。相對于國標(biāo)法，本法測定更快，前處理更簡單，每人每天能分析15～20個樣品，約為國標(biāo)法日處理量的3倍，提高了工作效率。

3 結(jié)論

采用加熱回流萃取、固相萃取凈化、HPLC法檢測煙草及煙草制品中MH殘留的方法，測定數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，重復(fù)性好，每人每天能分析15～20個樣品，適用于批量煙草樣品中MH殘留的快速檢測。

表3 本方法與國標(biāo)法測定的部分煙草樣品中MH殘留量（μg/g）

［1］王振榮，李布青.農(nóng)藥商品大全［M］.北京：中國商業(yè)出版社，1996.

［2］雷永和，李天飛.煙用化肥與農(nóng)藥［M］.昆明：云南科技出版社，1998.

［3］ISO 4876—1980 Tobacco and tobacco products-determination of maleic hydrazide residues［S］.

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［5］Renaud J M，Keller I，Vuillaume G..Determination of maleic hydrazide residues in cured tobacco by gas chromatography［J］.J Chromatogr A，1992，604（2-3）：243-246.

［6］John Lewis D，Barnes A，Wilkinson K，et al.Extraction of maleichydrazideresiduesfrompotatocrispsandtheir determinationusinghigh-performanceliquidchromatography with UV and atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometric detection［J］.J Chromatogr A，1996，750（1-2）：391-396.

［7］Dias A I，Duncan H J.Residues of free and bound maleic hydrazide in potato tubers［J］.Potato Res，1999，42（1）：89-93.

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［12］楊昀，劉玉林.煙葉和土壤中抑芽丹殘留分析方法及應(yīng)用研究［J］.分析化學(xué)，2004，32：410-410.

［13］全國農(nóng)藥殘留實驗研究協(xié)作組.農(nóng)藥殘留限量實用檢測方法手冊（第二卷）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001.

［14］GB/T 19611—2004煙草及煙草制品抑芽丹殘留量的測定紫外分光光度法［S］.