不同鹽對(duì)鯉魚肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和凝膠特性的影響＊

孔保華,李明清,夏秀芳

鯉魚 (Comm on carp,Cyprinus carpio)在淡水魚中所占比例很大,是一種非常重要的淡水資源。淡水魚除了鮮活食用外,大部分加工成魚糜制品。影響魚糜制品質(zhì)量的最主要的因素是肌原纖維蛋白,它是魚肉中含量最多的蛋白質(zhì),它結(jié)構(gòu)和性質(zhì)直接影響魚肉制品的結(jié)構(gòu)和功能特性[1]。目前國內(nèi)外研究較多的是以魚糜為原料,添加非肉蛋白質(zhì)和膠類對(duì)魚糜質(zhì)量的影響[2],而添加不同鹽對(duì)鯉魚肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)影響的研究并不多。在加工過程中,一些鹽類會(huì)對(duì)肉糜類制品的品質(zhì)產(chǎn)生影響,一定離子強(qiáng)度的鹽溶液可以提高肌原纖維蛋白的溶解性,改善凝膠特性,其中鈉離子和鈣離子對(duì)魚肉中肌原纖維蛋白的功能特性影響較大[3-4]。肌原纖維蛋白主要由肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白構(gòu)成,是魚肉的結(jié)構(gòu)蛋白,對(duì)魚肉制品的品質(zhì)有重要的影響[5]。在肉制品加工中利用鹽溶液對(duì)肌肉蛋白的凝膠效應(yīng)可以提高產(chǎn)品的品質(zhì),例如在肉中注入鹽水可以明顯提高肉的保水性和多汁性,并提高魚糜類制品的凝膠強(qiáng)度[6],在魚糜中添加焦磷酸鈉可以使魚糜凝膠的微觀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得細(xì)膩致密,從而可以保留更多的水分[7-8]。因此,本文以鯉魚為原料,提取肌原纖維蛋白后,添加不同濃度的NaCl,CaCl2和 Na4P2O7,研究鹽類對(duì)鯉魚肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)特性和凝膠特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮活鯉魚 (購于家樂福超市),體重約為 600 g。

1.2 儀器與設(shè)備

HR2860型飛利浦?jǐn)匕铏C(jī),AL-104型精密電子天平 (上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司),HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 (常州國華電器有限公司),TA-XT plus型質(zhì)構(gòu)分析儀 (英國 Stable Micro System公司),冷凍離心機(jī) (上海分析儀器公司),pHS-25型 pH計(jì)(上海精科雷磁儀器廠),JD500-2型電子天平 (沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司),精密電子天平 AL-104(上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司),紫外可見分光光度計(jì)UT-1800(北京普析通用儀器有限公司),精密增力電動(dòng)攪拌器 JJ-1(常州國華電器有限公司),Mini-4型電泳槽 (美國 Bio-rad公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鯉魚肌原纖維蛋白的提取

鯉魚宰殺去皮后,取背部白色肉。肌原纖維蛋白提取參照 Chin等的方法[9-10]并適當(dāng)修改。將魚肉攪碎,加入 4倍體積的 20 mmol/L pH值 7.5的冰磷酸鹽緩沖溶液均質(zhì),均質(zhì) 2次,每次 30 s,時(shí)間間隔 30 s,將其在 4℃冷凍離心機(jī)中 8 000 g離心 10 min,除去上清液。取沉淀用 4倍體積 pH值 7.5的 20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液清洗沉淀,重復(fù) 3次,最后一次清洗后用 5層紗布過濾,所得濾液離心。沉淀為肌原纖維蛋白樣品,用凱氏定氮方法測定其蛋白含量。將肌原纖維蛋白配制為蛋白含量為 40 mg/mL的溶液,分別添加不同濃度的 NaCl、CaCl2和 Na4P2O7,進(jìn)行肌原纖維蛋白的溶解性、凝膠性、凝膠微觀結(jié)構(gòu)、濁度和表面疏水性等指標(biāo)的測定。

1.3.2 肌原纖維蛋白等電點(diǎn)的測定

等電點(diǎn)的測定參照 Tang[11]的方法,稱取肌原纖維蛋白樣品與蒸餾水 1∶100(g∶mL)混合,用 0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié) pH值 8.0,室溫下磁力攪拌 1h后,4 000 r/min離心 20 min,取等量上清液,用 0.1 mol/L HCl調(diào)至不同 pH值 (3～6.5)沉淀蛋白質(zhì),離心后采用雙縮脲法分別測定離心沉淀前后上清液中肌原纖維蛋白,上清液中蛋白質(zhì)殘留率最低時(shí)的 pH值即為肌原纖維蛋白的等電點(diǎn)。其公式如下:

1.3.3 肌原纖維蛋白 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參照 Laemmli的 SDS[12]不連續(xù)電泳方法,分離膠濃度 10%,濃縮膠濃度 5%,電極緩沖液為 0.05 mol/L Tris,0.384 mol/L甘氨酸,0.1%SDS(pH值8.3)的混合溶液。電泳膠的厚度為 1 mm,進(jìn)樣量為15μL,進(jìn)樣濃度為 1 mg/mL,電泳開始時(shí)調(diào)節(jié)電壓為80 V,當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)節(jié)為 120V。

1.3.4 肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu) (TPA)的測定

將肌原纖維蛋白溶液 (40 mg/mL),分別添加不同濃度的 NaCl、CaCl2和 Na4P2O7,在 80℃水浴下加熱 45 min,冷卻,放置 4℃冰箱 12 h,形成肌原纖維蛋白凝膠。肌原纖維蛋白凝膠 (直徑 30 mm高度 25 mm)在室溫下放置 30 min,用質(zhì)構(gòu)分析儀測定。將待測樣品置于測定平臺(tái)上固定好,室溫下利用物性分析儀進(jìn)行測量。以質(zhì)構(gòu)剖面分析方法 (texture profile analyses,TPA)測定凝膠的硬度和彈性等,選用的參數(shù)分別為:S MS P/50探頭,測前速度 5 mm/s,測試速度 1 mm/s,觸發(fā)力 1g,壓縮距離 50%。所有樣品做 3次平行試驗(yàn),結(jié)果取平均值。

1.3.5 肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察(掃描電鏡)

取肌原纖維蛋白凝膠樣品,切成約 (2×5)mm的小條,用 pH值 6.8濃度為 2.5%的戊二醛浸泡 12 h固定。用 0.1mol/L pH值 6.8磷酸緩沖液洗滌 3次,每次 10 min。分別用體積分?jǐn)?shù) 50%、70%、80%和 90%的乙醇進(jìn)行脫水,每次 10 min;然后用 100%乙醇脫水 3次,每次 10 min。最后用三氯甲烷脫脂1h,再分別用 100%乙醇∶叔丁醇體積比為 1∶1和叔丁醇進(jìn)行置換各 1次,每次 15 min。樣品用 ES-2030(H ITACH I)型冷凍干燥儀進(jìn)行干燥。將凝膠樣品觀察面向上緊密粘貼在掃描電鏡樣品臺(tái)上,在離子濺射噴金過程中,用 E-1010(Giko)型離子濺射鍍膜儀將樣品表面噴金,處理好樣品之后,放入掃描電鏡的樣品盒中待檢,加速電壓為 5kV,放大倍數(shù)為 300倍,進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.3.6 肌原纖維蛋白表面疏水性的測定

表面疏水性的測定依據(jù) Chelh的方法[13]。將肌原纖維蛋白溶于 pH值 7、20 mmol/L的磷酸鹽溶液中,蛋白濃度為 5 mg/mL,在 80℃加熱 30 min,取 1 mL蛋白溶液,加入 200μL濃度為 1 mg/mL溴酚藍(lán),以無肌原纖維蛋白的磷酸鹽溶液為對(duì)照。在 2 000 g離心 15 min,取上清液稀釋 10倍,在 595 nm處測定吸光值。表面疏水性用以下公式表示:

式中:A對(duì)照為對(duì)照組的吸光值,A樣品為處理組的吸光值。

1.3.7 肌原纖維蛋白濁度的測定

肌原纖維蛋白濁度的測定按照 Benjakul等的方法測定[14-15]。肌原纖維蛋白溶液配制為 1 mg/mL,溶液取 5 mL,分別在 80℃的水浴鍋中加熱 30 min,冷卻后在 600nm處測定吸光值。以不加蛋白的空白溶液為對(duì)照。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù) 3次,結(jié)果表示為平均數(shù) ±SD。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用 Statistix 8.1(分析軟件,St Paul,MN)軟件包中 LinearModels程序進(jìn)行,差異顯著性(P＜0.05)分析使用 Tukey HSD程序。采用 sigmaplot 11.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯉魚肌原纖維蛋白等電點(diǎn)的測定

圖1 鯉魚肌原纖維蛋白的等電點(diǎn)

由圖1中可以看出,鯉魚肌原纖維蛋白在不同pH值條件下經(jīng)過沉淀后,上清液中蛋白含量呈先下降后升高的趨勢。上清液中殘留的肌原纖維蛋白含量在 pH值 5.5時(shí)最低,蛋白含量趨向于 0,而在 pH值 5.5附近殘留蛋白質(zhì)含量均較高。由此可見,pH值 5.5為肌原纖維蛋白的等電點(diǎn),該結(jié)果與 Fennema[16]的結(jié)果一致。

2.2 肌原纖維蛋白 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

肌原纖維蛋白的電泳圖譜如圖2所示。從圖2中可以得出,肌原纖維蛋白主要包括 17～20 ku的肌球蛋白輕鏈、35 ku的肌原蛋白 (troponin,T)的一個(gè)亞基 (原肌球蛋白結(jié)合亞基)、36 ku的原肌球蛋白(tropomysin)、43 ku的肌動(dòng)蛋白 (Actin)、100 ku的副肌球蛋白 (paramyosin)和 220 ku的肌球蛋白重鏈,結(jié)果與Lametsch等[17-18]相一致。在肌原纖維蛋白中添加 NaCl,CaCl2和 Na4P2O7的蛋白樣品中,會(huì)使肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白輕鏈條帶變深,同時(shí)在條帶上部(66～200 ku)出現(xiàn)分子質(zhì)量較大細(xì)小條帶,而肌原蛋白 T的條帶變淺,說明添加這 3種鹽會(huì)使一些蛋白質(zhì)發(fā)生一定的聚合作用。特別是添加磷酸鹽 Na4P2O7的樣品聚合程度要高一些。以上結(jié)果與 Glibowski[19]試驗(yàn)一致。

圖2 肌原纖維蛋白 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜

2.3 添加不同鹽對(duì)肌原纖維蛋白凝膠硬度和彈性的影響

由圖3可知,NaCl、CaCl2和 Na4P2O7的添加使肌原纖維蛋白凝膠的硬度下降。在添加Na4P2O7組中,肌原纖維蛋白凝膠硬度比添加 CaCl2組中凝膠硬度下降的較少 (P＜0.05)。添加 NaCl組和添加Na4P2O7組的肌原纖維蛋白凝膠硬度差異不顯著 (P＞0.05)。3種鹽的添加使肌原纖維蛋白凝膠彈性大都呈現(xiàn)下降的趨勢。在添加 NaCl和 CaCl2組中,肌原纖維蛋白凝膠的彈性隨著鹽添加量的增大而降低。添加 NaCl組中肌原纖維蛋白凝膠的彈性比添加CaCl2組的彈性要下降少。在添加 Na4P2O7組中,肌原纖維蛋白凝膠的彈性先增加然后減少,在添加量為0.5%處凝膠的彈性達(dá)到最大值。且添加 Na4P2O7組凝膠的彈性顯著高于 NaCl和 CaCl2組 (P＜0.05)。

鹽對(duì)肌原纖維蛋白的變性機(jī)理仍在研究中,因此蛋白凝膠的形成過程中鹽的作用也不是很明確。以上試驗(yàn)結(jié)果可能的原因是,一些鹽可以提高蛋白變性的溫度,這些鹽可以加強(qiáng)蛋白的水合作用,且與水價(jià)鍵結(jié)合能力較弱;而另一些鹽使蛋白凝膠的變性溫度降低,這些鹽降低蛋白的水合作用且水合能力較強(qiáng),此外,加熱形成凝膠中,由于鹽濃度提高蛋白變性溫度,影響了凝膠形成的第二階段的蛋白之間聚合[20]。也可能因?yàn)轸~肉中含有大量的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶,這些酶在離子強(qiáng)度較低時(shí)更加有效地將肌球蛋白交聯(lián),鹽的添加降低了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性,使凝膠的強(qiáng)度下降,此外,添加焦磷酸鈉提高了肌原纖維蛋白的溶解性,超出了凝膠的最適條件。因此添加 3種鹽蛋白凝膠的硬度和彈性呈現(xiàn)下降的趨勢。

圖3 不同鹽對(duì)肌原纖維蛋白凝膠硬度和彈性的影響

2.4 添加鹽對(duì)肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

肌原纖維蛋白添加 0.5%NaCl、CaCl2和 Na4P2O7后形成凝膠微觀結(jié)構(gòu)的變化如圖4所示。由圖4中可以看出,添加 NaCl所成凝膠結(jié)構(gòu)比對(duì)照組凝膠樣品致密,使細(xì)膠束聚集增加,網(wǎng)狀孔隙變小,網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)比較有序,這樣的結(jié)構(gòu)能更好的保持住凝膠的水分。添加 CaCl2凝膠微觀結(jié)構(gòu)變粗糙,膠束分布不均勻,并且結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)碎片,有的形成斷層狀,使凝膠的吸水和保持水分的能力降低,凝膠的孔徑變大結(jié)構(gòu)松散。添加Na4P2O7的肌原纖維蛋白凝膠表面致密,孔徑很小,而對(duì)照組凝聚空間多孔不規(guī)則、粗糙。

圖4 不同鹽對(duì)肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響(×300)

2.5 鹽濃度對(duì)肌原纖維蛋白濁度和表面疏水性的影響

濁度可以表明蛋白質(zhì)的凝聚程度,反映了溶液中蛋白質(zhì)懸浮粒子的大小和數(shù)量。沒有發(fā)生凝聚的蛋白質(zhì)分散時(shí)懸浮顆粒直徑較小,濁度小;蛋白質(zhì)聚集后,懸浮顆粒直徑增大,濁度升高。不同添加物對(duì)肌原纖維蛋白濁度的影響如圖5所示。

圖5 不同添加物對(duì)肌原纖維蛋白濁度的影響

3種鹽明顯降低了肌原纖維蛋濁度,在同一鹽濃度下 CaCl2影響最明顯,且與對(duì)照組相比差異顯著 (P＜0.05)。這是因?yàn)榧≡w維蛋白是鹽溶性蛋白,在鹽溶液中蛋白溶解蛋白分散,吸光值下降,在水溶液中蛋白聚集,吸光值最大。因此,在生產(chǎn)魚類制品時(shí)要充分利用肌原纖維蛋白更易溶解于鹽溶液中的特性,來提高魚糜類制品的質(zhì)量。圖6為不同鹽對(duì)鯉魚肌原纖維蛋白表面疏水性的影響。NaCl和 Na4P2O7顯明的降低肌原纖維蛋白的表明疏水性,這也說明蛋白質(zhì)的溶解性增加。在添加 Na4P2O7的肌原纖維蛋白組中下降程度比添加 NaCl組的表面疏水性下降程度大 (P＜0.05)。在添加 NaCl條件下,肌原纖維蛋白表面疏水性在 0～0.25%下降顯著 (P＜0.05),進(jìn)一步增大濃度,肌原纖維蛋白的表面疏水性變化不顯著 (P＞0.05),可能因?yàn)榧≡w維蛋白是鹽溶性的蛋白,在一定離子強(qiáng)度的鹽溶液中,可以增加肌原纖維蛋白的溶解性[7]。添加 CaCl2的組中,由于 CaCl2與溶液中的試劑反應(yīng),方法不適用,所以沒有將數(shù)據(jù)列出。

3 結(jié)論

圖6 不同鹽濃度對(duì)鯉魚肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

將 NaCl、CaCl2和 Na4P2O7添加到鯉魚魚糜中,對(duì)肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)和凝膠特性產(chǎn)生不同的影響:鹽類使肌原纖維蛋白發(fā)生一定程度的聚集和降解、表面疏水性降低,溶解性增加;同時(shí)也降低了肌原纖維蛋白凝膠硬度、彈性、濁度,且隨著鹽濃度的增加影響越明顯,其中 CaCl2對(duì)肌原纖維蛋白的影響最明顯。從肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)可以看出,NaCl和Na4P2O7使凝膠的微觀結(jié)構(gòu)變致密,CaCl2使凝膠微觀結(jié)構(gòu)變松散。3種鹽對(duì)鯉魚肌原纖維蛋白的分子量影響不明顯。因此,在鯉魚制品深加工過程中,適當(dāng)添加各種鹽類可明顯影響制品的質(zhì)量。

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