酸棗仁安神酒中酸棗仁皂苷改善小鼠睡眠作用的研究

王紅磊，汪芳安

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023)

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們工作以及生活的壓力越來越大，失眠問題己經(jīng)成為困擾人們生活的重要因素之一。WHO的一項(xiàng)研究表明，全球約有27%的人正面臨失眠的困擾。目前改善睡眠狀況的研究多集中在安定、褪黑素等方面，短期改善睡眠狀況雖有一定的效果，但長(zhǎng)期服用會(huì)產(chǎn)生藥物依賴性與毒副作用。酸棗仁為鼠李科植物酸棗的干燥成熟種仁，酸棗仁為藥食同源的保健食品原料，醫(yī)書記載其味甘，性平，具寧心安神、養(yǎng)肝、生津斂汗之功效。主治虛煩不眠，驚悸多夢(mèng)，體虛多汗，津傷口渴，為常用改善失眠中藥。酸棗仁皂苷是酸棗仁中鎮(zhèn)靜催眠的有效成分之一，為三萜類化合物［1-2］。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察酸棗仁皂苷對(duì)小鼠改善睡眠功能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

秒表、分析天平、電子稱、灌胃針、1 mL注射器等。

1.2 試劑

酸棗仁藥材(武漢生達(dá)新世紀(jì)大藥房(由本室鑒定))，戊巴比妥鈉(北京強(qiáng)欣博瑞生物技術(shù)有限公司)，褪黑素(深圳喜力健生物科技有限公司)。黃酒(自制)，乙醇試劑(分析純)，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

選用同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖的清潔級(jí)5—6周齡昆明種雄性小鼠，體重(20±2)g。

1.4 酸棗仁皂苷的提取

1.4.1 乙醇超聲提取酸棗仁皂苷

精密稱取酸棗仁皂苷50g，按料液比1∶10加入70%乙醇500mL，超聲溫度40℃，超聲時(shí)間40 min，超聲功率70 W，在上述條件下超聲提取2次，合并提取液，應(yīng)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮蒸干乙醇，得酸棗仁皂苷乙醇提取物。

1.4.2 蒸餾水回流提取酸棗仁皂苷

稱取酸棗仁粉末20g，加5倍體積水浸泡1h，加熱煎煮1h，過濾取濾液，其濾渣再加5倍體積水煎煮40min，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得酸棗仁皂苷濃縮水煎液。

1.5 樣品及供試液制備

酸棗仁安神酒：將酸棗仁皂苷乙醇提取物用適量黃酒溶解，配成400mg/kg、200 mg/kg酸棗仁皂苷酒溶液。

酸棗仁皂苷水煎液［3］：將酸棗仁皂苷濃縮水煎液配制成至相當(dāng)于藥粉濃度為2g/mL的溶液。

褪黑素水溶液：取褪黑素4片，3 mg/片，加水定容到50mL，配制成0.24mg/mL褪黑素水溶液。

戊巴比妥鈉水溶液：精密稱取戊巴比妥鈉粉末500mg，加水溶解定容到100mL，配制成5mg/mL戊巴比妥鈉水溶液

2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法依據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)中改善睡眠功能檢測(cè)方法［5］。

2.1 對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響［4］

選48只小鼠，隨機(jī)分為4個(gè)劑量實(shí)驗(yàn)組和2個(gè)陰性實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，每組8只。實(shí)驗(yàn)組分別灌胃給予1.5項(xiàng)中制備的樣品溶液，陰性對(duì)照組給予等量的蒸餾水和等量的黃酒溶液，灌胃量為0.2 mL/10 g BW。各組每日上午9∶00-10∶00灌胃給藥1次，連續(xù)5d，并在末次灌胃前禁食24 h。末次給藥45 min后，將小鼠置于紙箱內(nèi)，使其適應(yīng)5 min后，記錄5 min內(nèi)活動(dòng)次數(shù)(測(cè)定小鼠走動(dòng)時(shí)間及雙前肢向上抬舉次數(shù))。如實(shí)驗(yàn)組小鼠走動(dòng)時(shí)間和雙上肢抬舉次數(shù)減少并與陰性對(duì)照組有顯著性差異，即判定該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

2.2 直接睡眠試驗(yàn)

小鼠和劑量試驗(yàn)組以及陰性對(duì)照組同2.1項(xiàng)。灌胃量0.2mL/10g BW，各組每日上午9∶00—10∶00灌胃給藥1次，連續(xù)10d，末次樣品給藥后觀察小鼠的睡眠情況。睡眠以翻正反射消失為判斷指標(biāo)，當(dāng)小鼠置于背臥位時(shí)，能立即翻正身位，如超過60s不能翻正者，即認(rèn)為翻正反射消失，進(jìn)入睡眠，從翻正反射消失至翻正反射恢復(fù)的時(shí)間為小鼠睡眠時(shí)間，觀察各組小鼠的睡眠發(fā)生率、入睡動(dòng)物數(shù)及睡眠時(shí)間。如試驗(yàn)組入睡動(dòng)物數(shù)及睡眠時(shí)間增加并與陰性對(duì)照組有顯著性差異，即判定該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

2.3 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間試驗(yàn)

小鼠分組及給樣品方法同2.1項(xiàng)。在末次樣品給藥20min后，各組小鼠按50 mg/kg BW劑量腹腔注射戊巴比妥鈉，注射量為0.2 mL/20g BW。以小鼠的翻正反射消失為睡眠判斷指標(biāo)，觀察小鼠對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間延長(zhǎng)的影響。如實(shí)驗(yàn)組小鼠的睡眠時(shí)間比陰性對(duì)照組延長(zhǎng)并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即判定該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

2.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗(yàn)

小鼠分組及給樣品方法同2.1項(xiàng)。在末次樣品給藥20min后，各組小鼠按45 mg/kg BW劑量腹腔注射巴比妥鈉。觀察30 min內(nèi)小鼠的睡眠情況，以翻正反射消失達(dá)60 s以上為入睡判斷標(biāo)準(zhǔn)，記錄各組的入睡的小鼠個(gè)數(shù)，計(jì)算入睡小鼠發(fā)生率。如實(shí)驗(yàn)組入睡小鼠發(fā)生率高于陰性對(duì)照組并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即判定該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。小鼠自主活動(dòng)計(jì)數(shù)、延長(zhǎng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠時(shí)間結(jié)果以(ˉx±s)表示，顯著性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)，協(xié)同戊巴比妥鈉法結(jié)果用x表示，顯著性檢驗(yàn)用X2檢驗(yàn)

3 結(jié)果與分析

3.1 對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響

各劑量實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在給予樣品后，有部分小鼠表現(xiàn)為靜臥，有少量活動(dòng)，自主活動(dòng)明顯減少，陰性對(duì)照組活動(dòng)正常。5 min內(nèi)小鼠活動(dòng)如下表1、表2所示。

表1 灌胃5d樣品組對(duì)小鼠走動(dòng)時(shí)間的影響(±s)

表1 灌胃5d樣品組對(duì)小鼠走動(dòng)時(shí)間的影響(±s)

注：褪黑素與皂苷水煎液與蒸餾水空白對(duì)照;皂苷酒溶液與黃酒空白對(duì)照;下同。

組別 只數(shù)/只 灌胃5d在5min內(nèi)走動(dòng)時(shí)間/s P值蒸餾水陰性對(duì)照組8120.37 ±10.74 ---黃酒陽(yáng)性對(duì)照組 8113.50 ±14.13 ---褪黑素組 888.75 ±16.930.006酸棗仁酒大劑量 873.50 ±12.700.000酸棗仁酒小劑量 873.50 ±16.240.004皂苷水煎液874.38 ±25.920.006

表2 灌胃5d樣品組對(duì)小鼠雙前肢向上抬舉次數(shù)的影響(±s)

表2 灌胃5d樣品組對(duì)小鼠雙前肢向上抬舉次數(shù)的影響(±s)

對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響實(shí)驗(yàn)表明，小鼠走動(dòng)時(shí)間各樣品組與對(duì)應(yīng)空白組比較有顯著性差異;小鼠雙上肢抬舉次數(shù)各樣品組與對(duì)應(yīng)空白組比較差異有顯著性意義。

3.2 直接睡眠實(shí)驗(yàn)

各劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠在給予樣品后，小鼠多表現(xiàn)為安靜和活動(dòng)減少，但沒有翻正反射消失者，陰性對(duì)照組動(dòng)物全部清醒，表明各樣品組對(duì)小鼠都沒有直接睡眠作用，見表3。

表3 各組小鼠的直接睡眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)

由表4可見，各劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠的睡眠時(shí)間均比陰性對(duì)照組的時(shí)間長(zhǎng)，且各劑量實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的差異均具有極顯著性(P＜0.01)，皂苷水煎液組與對(duì)照組的差異具有顯著性(P＜0.05)，表明該樣品組能延長(zhǎng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時(shí)間。

表4 受試物對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間的影響(±s)

表4 受試物對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間的影響(±s)

3.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗(yàn)

結(jié)果見表5，各劑量實(shí)驗(yàn)組的小鼠入睡率高于陰性對(duì)照組，且各劑量實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的差異均具有顯著性(P＜0.05)，表明各樣品組與閾下劑量的戊巴比妥鈉有協(xié)同催眠作用。

表5 對(duì)閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠發(fā)生率的影響

3.5 結(jié)果判定

延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，且無明顯直接睡眠作用，可判定酸棗仁皂苷酒溶液以及皂苷水煎液均具有改善睡眠功能作用。

4 結(jié)束語(yǔ)

失眠是臨床多發(fā)疾病，病因復(fù)雜多樣。目前國(guó)內(nèi)外常用的西醫(yī)藥鎮(zhèn)靜催眠藥都有一定的副作用和藥物依賴性，往往吃藥有一定效果，停藥又復(fù)發(fā)失眠，其中有的可能引起藥源性疾病。而養(yǎng)心安神藥酸棗仁為祖國(guó)醫(yī)學(xué)中治療失眠的常用中藥，被廣泛應(yīng)用在很多治療失眠的藥方中，雖然其具體改善睡眠的機(jī)理目前并不是很明確，但其確切的療效比較顯而易見的［3］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酸棗仁安神酒、酸棗仁水溶液對(duì)小鼠的自主活動(dòng)均有明顯的抑制作用：均能明顯增加閾下劑量戊巴比妥鈉的小鼠入睡率，能明顯延長(zhǎng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠時(shí)間，這些結(jié)果說明酸棗仁中酸棗仁皂苷具有一定的鎮(zhèn)靜催眠作用。

［1］ 高劍鋒，許萬(wàn)玉.酸棗仁皂苷的研究綜述［J］.中國(guó)藥師.2008，11(11)：1376-1378.

［2］ 郭勝民，范曉雯.酸棗仁總皂甙的中樞抑制作用［J］.西北醫(yī)學(xué)志，1996.8(11)：166.

［3］ 游秋云，王平，章程鵬，等.龍骨、酸棗仁對(duì)小鼠鎮(zhèn)靜催眠作用的對(duì)比研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007.9(5)：28-29.

［4］ 吳玉蘭，許惠琴.酸棗仁不同炮制品及炒酸棗仁中總黃酮與總皂苷的鎮(zhèn)靜催眠作用比較［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥.2005.16(9)：868-869.

［5］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范［M］.北京：清華同方電子出版社(3 版)，2003.