2,4-D對(duì)小麥胚愈傷組織誘導(dǎo)及其形成的影響

鄒亞麗，王廷璞，劉瑞媛，馬偉超，李一婧

（天水師范學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅 天水 741001）

2,4-D對(duì)小麥胚愈傷組織誘導(dǎo)及其形成的影響

鄒亞麗，王廷璞，劉瑞媛，馬偉超，李一婧

（天水師范學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅 天水 741001）

為建立有效的小麥細(xì)胞誘導(dǎo)再生培養(yǎng)體系，以中梁22小麥幼胚和成熟胚為材料，分別在含不同濃度2,4-D的HB和MS培養(yǎng)基上進(jìn)行組織培養(yǎng)，研究其對(duì)小麥幼胚和成熟胚愈傷組織形成的影響.結(jié)果表明：不同濃度2,4-D的處理之間存在顯著差異，濃度為0.5mg/L的2,4-D的誘導(dǎo)率最高達(dá)到78.6%，有利于形成胚性愈傷組織；不同培養(yǎng)基之間差異顯著，HB培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率高于MS培養(yǎng)基；不同外植體之間差異不顯著.

小麥；幼胚；成熟胚；愈傷組織

小麥作為重要的糧食作物，在世界范圍內(nèi)的種植面積和總量均超過(guò)其他農(nóng)作物，在我國(guó)小麥的種植面積和總產(chǎn)量?jī)H次于水稻.小麥蛋白質(zhì)含量可達(dá)其干重的10%，是人類蛋白質(zhì)的主要攝入來(lái)源.但在小麥的生產(chǎn)過(guò)程中，因不斷受到生物、非生物等因素的脅迫，嚴(yán)重影響了其產(chǎn)量和品質(zhì).隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用基因工程技術(shù)對(duì)小麥進(jìn)行品種改良越來(lái)越受到重視.自20世紀(jì)80年代人們開(kāi)始研究轉(zhuǎn)基因植物以來(lái)，利用轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)對(duì)小麥進(jìn)行抗蟲(chóng)、抗病、抗逆及品質(zhì)改良等方面已取得較大進(jìn)展.[1]但在小麥組織培養(yǎng)體系中，外植體離體再生頻率低，因此研究小麥組織培養(yǎng)條件和植株再生頻率的影響因素仍然是小麥轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的重要課題之一.近年來(lái)，研究者對(duì)影響小麥組織培養(yǎng)的因素如基因型、外植體來(lái)源、培養(yǎng)基類型及成分等進(jìn)行了大量的研究.[2-12]研究表明，2,4-D是誘導(dǎo)禾本科植物體細(xì)胞發(fā)生的重要因素[13]，不同的外植體和培養(yǎng)基同樣也影響著小麥愈傷組織的誘導(dǎo).[14]本文對(duì)天水地區(qū)主栽小麥品種中梁22號(hào)的幼胚和成熟胚進(jìn)行了組織培養(yǎng)，研究了不同外植體、培養(yǎng)基和激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，目的在于為小麥育種尋求較好的轉(zhuǎn)基因受體并建立成熟的小麥再生體系奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為中梁22號(hào)，天水市農(nóng)科所中梁站提供.

1.2 方法

1.2.1 成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)

將選好的小麥種子用無(wú)菌水洗5～8遍后在室溫下浸泡約12h，在超凈工作臺(tái)上用70%酒精將泡好的種子浸10s后用無(wú)菌水洗3遍，再用0.1%的HgCl2滅菌15min后用無(wú)菌水洗5遍.用解剖刀將處理好的小麥放入預(yù)先滅完菌的培養(yǎng)皿中剝?nèi)∨撸婆邥r(shí)將胚夾破，盾片朝上分別接入誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中培養(yǎng).培養(yǎng)室溫度為25℃，光源為日光燈，每天光照12h，誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)用散射光.[15]

1.2.2 幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)

取開(kāi)花15d左右的小麥幼穗放入預(yù)先滅完菌的空錐形瓶中用70%的酒精浸泡20s，倒出酒精用無(wú)菌水沖洗3次后再用HgCl2泡5min，最后用無(wú)菌水沖洗3遍.用鑷子或解剖針剝開(kāi)葉鞘取出幼胚，盾片朝上接于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng).

1.3 培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)采用的是MS培養(yǎng)基和HB培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基均添加0.5mg/L、2.0 mg/L和3.0 mg/L3個(gè)不同濃度水平的2,4-D，共六種培養(yǎng)基.

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

愈傷組織誘導(dǎo)率計(jì)算公式：愈傷組織誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)愈傷組織數(shù)/離體胚數(shù))×100%.

利用最小差數(shù)檢驗(yàn)法和t檢驗(yàn)法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

小麥幼胚愈傷組織在接種6d后長(zhǎng)出愈傷組織，誘導(dǎo)出的愈傷組織在形態(tài)上主要有兩種類型：一種為白灰色水浸狀愈傷組織，較少；另一種為淡黃致密型胚性愈傷組織，居多.成熟胚接種2d后，離體胚有出芽現(xiàn)象；4d后大多數(shù)離體胚都能看到明顯的半透明狀的愈傷組織.雖然小麥幼胚的誘導(dǎo)率高于小麥成熟胚的誘導(dǎo)率（見(jiàn)表1），但方差結(jié)果表明小麥幼胚與成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率的差異并不顯著（見(jiàn)表2）.

表1 不同外植體對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表2 不同外植體對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)影響的t檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 2,4-D對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表3可知，培養(yǎng)基中添加的2,4-D濃度不同，愈傷組織的類型、質(zhì)地、顏色和生長(zhǎng)狀況等都有較大差異；濃度為0.5mg/L的2,4-D培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最高.通過(guò)最小顯著差數(shù)法比較（見(jiàn)表4）可知，濃度為0.5mg/L的2,4-D的誘導(dǎo)率最高，濃度為2.0mg/L和3.0mg/L的2,4-D培養(yǎng)基之間差異不顯著.

表3 不同2,4-D濃度對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表4 不同2,4-D濃度對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)影響的方差分析表

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表5和表6可知，HB培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)有顯著差異.實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在HB培養(yǎng)基上，不論是小麥幼胚還是成熟胚均大約在2～5d左右即可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，而在MS上則需要大約8～9d才可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；所產(chǎn)生的愈傷形態(tài)主要有淡黃致密和白至灰色松軟兩種；在同一種培養(yǎng)基上，不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織的質(zhì)量相差不大.

表5 不同培養(yǎng)基對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表6 不同培養(yǎng)基對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)的影響的方差分析表

3 討 論

3.1 小麥愈傷組織誘導(dǎo)外植體的選擇

愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖主要依賴于外植體本身、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件三方面因素的共同作用.在目前的組織培養(yǎng)技術(shù)條件下，選擇適宜的外植體和培養(yǎng)基是主要的研究?jī)?nèi)容.其中在外植體的選擇方面，除基因型之外，外植體的生長(zhǎng)發(fā)育階段和生理狀態(tài)是人們較難控制的，因而對(duì)外植體的篩選是植物組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù).目前，誘導(dǎo)小麥胚性愈傷組織的外植體包括幼胚、幼穗、花藥、成熟胚等，其中幼胚因其具有容易產(chǎn)生胚性愈傷組織且再生能力較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛應(yīng)用.[16]成熟胚與幼胚相比，雖然愈傷組織的芽分化頻率較底，但因其易于獲取，不受季節(jié)植株發(fā)芽時(shí)期的限制，具備取材方便、操作簡(jiǎn)單、愈傷組織成長(zhǎng)快和一次成苗率高等特點(diǎn)已得到廣泛的研究和應(yīng)用.[17-19]

本研究發(fā)現(xiàn)，幼胚比成熟胚易于誘導(dǎo)，這是由于幼胚組織比較幼嫩，接近于胚性細(xì)胞，因此更加容易脫分化.但小麥幼胚愈傷組織的褐變現(xiàn)象較嚴(yán)重，其可能有兩方面的原因：一是半透明狀的愈傷組織含水量大，在轉(zhuǎn)移過(guò)程中容易造成機(jī)械損傷；二是培養(yǎng)基中的激素成分對(duì)愈傷組織造成了一定傷害.[15]同時(shí)，小麥幼胚的生長(zhǎng)發(fā)育階段和生理狀態(tài)也會(huì)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和愈傷組織的質(zhì)量產(chǎn)生重要影響.本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)過(guò)程中，把成熟胚夾破有助于愈傷組織的形成.

3.2 2,4-D濃度在小麥愈傷組織誘導(dǎo)中的確定

2,4-D是大多數(shù)植物離體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織最有效的物質(zhì)，它能誘發(fā)細(xì)胞分裂活動(dòng)，引起細(xì)胞脫分化和無(wú)序增殖，產(chǎn)生愈傷組織.在以前的研究報(bào)道中，大多數(shù)認(rèn)為2.0mg/L的2,4-D是小麥成熟胚和幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的適宜濃度.[20-22]而通過(guò)本實(shí)驗(yàn)表明，0.5mg/L的2,4-D對(duì)小麥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，這和趙永英等人對(duì)鄭麥9203胚性愈傷組織誘導(dǎo)的研究結(jié)果是一致的.[11]通過(guò)方差分析表明，三種濃度的2,4-D對(duì)小麥愈傷組織出愈數(shù)的影響顯著，而2mg/L與3mg/L的2,4-D對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)的影響差異并不顯著，這也許與小麥的基因型有關(guān)。因此，確定適宜的外源激素及其濃度對(duì)小麥愈傷組織的影響還有待于進(jìn)一步的研究.

3.3 不同培養(yǎng)基對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由于不同培養(yǎng)基所含的各種營(yíng)養(yǎng)成分和激素種類有所不同，從而直接地影響著愈傷組織的形成、增殖和愈傷組織的質(zhì)量.因此，必須根據(jù)所需誘導(dǎo)的外植體選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在誘導(dǎo)效果上，不論是幼胚還是成熟胚的愈傷組織的誘導(dǎo)，在HB培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織生長(zhǎng)快、體積大、色澤鮮潤(rùn)，質(zhì)量、生長(zhǎng)量等指標(biāo)均優(yōu)于MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織.

3.4 其他因素對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)的作用

在組織培養(yǎng)中，避免污染是獲得理想結(jié)果的關(guān)鍵.因此，接種和培養(yǎng)都要求在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下操作.在本實(shí)驗(yàn)中，出現(xiàn)了一些染菌情況，且多為霉菌和細(xì)菌.此外，盾片的接入方式也會(huì)影響愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織的質(zhì)量，并會(huì)對(duì)分化產(chǎn)生一定的影響.

總之，小麥愈傷組織的誘導(dǎo)是一個(gè)復(fù)雜的連續(xù)的體系，針對(duì)某一個(gè)方面進(jìn)行單一因素的研究勢(shì)必要受到其他因素的影響.因此，在今后的相關(guān)研究中，應(yīng)該綜合考慮多種因素對(duì)小麥愈傷組織的誘導(dǎo)率和胚性愈傷組織形成的影響.

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S512.1+1

A

1671-1351（2011）02-0033-03

2010-08-22

鄒亞麗 (1971-)，女，甘肅天水人，天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院講師，碩士.

天水師范學(xué)院科研基金資助項(xiàng)目“小麥轉(zhuǎn)β-1,3-葡聚糖酶及幾丁質(zhì)酶基因抗條銹的研究”（TSA0624）階段性成果

〔責(zé)任編輯 馬旭光〕