＊ 三株桃小食心蟲病原真菌的分離及形態(tài)鑒定

朱永敏,李捷,熊琦,謝映平,薛皎亮

(1.山西大學生命科學學院,山西太原 030006;2.山西省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,山西太原 030031)

＊三株桃小食心蟲病原真菌的分離及形態(tài)鑒定

朱永敏1,李捷2,熊琦1,謝映平1,薛皎亮1＊

(1.山西大學生命科學學院,山西太原 030006;2.山西省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,山西太原 030031)

從山西襄汾蘋果園越冬的桃小食心蟲(Carposina sasakiiMatsmura)采集獲得自然染病的蟲體,經(jīng)分離純化得到三株病原真菌,編號分別為 TSL01、TSL02、TSL03,通過回接試驗證明這3株菌株為桃小食心蟲的病原菌.根據(jù)培養(yǎng)性狀和顯微形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn):3株菌株在PDA培養(yǎng)基上均為白色,菌株 TSL 01和 TSL03菌落大,可產(chǎn)生黃褐色或淡紫色色素.它們都產(chǎn)生兩種類型的分生孢子,大型分生孢子,月牙形或鐮刀形,有隔;小型分生孢子,橢圓形,腎形或卵圓形,假頭狀著生,菌絲透明有隔,輪狀生長;菌株 TSL02菌落較小,后期產(chǎn)生黃色色素,分生孢子圓柱形至梭形,串生,分生孢子梗呈“Y”形.初步鑒定菌株 TSL01與菌株 TSL03為鐮孢菌屬(Fusarium)尖孢鐮孢菌(F.oxysporum),菌株TSL02為擬青霉屬(Paecilom yces)粉質(zhì)擬青霉(P.farinosus).這是在桃小食心蟲上首次記錄該兩類病原菌.

桃小食心蟲;病原真菌;形態(tài)鑒定

桃小食心蟲(Carposina sasakiiM atsm ura),簡稱桃小,隸屬鱗翅目Lepidop tera、蛀果蛾科Carposinldae,是我國北方果樹生產(chǎn)中發(fā)生面積最普遍、危害最大的食心蟲類害蟲,可危害蘋果、棗、梨、桃、杏等十多種果樹的果實[1].目前桃小食心蟲的防治仍以化學殺蟲劑為主,化學殺蟲劑雖具有見效快、成本低的優(yōu)點,但常年用藥防治次數(shù)過多,不僅使害蟲產(chǎn)生抗藥性,還會污染環(huán)境、殺死天敵、農(nóng)藥殘留,對果品安全構(gòu)成極大威脅,大力推行和普及生物防治技術(shù)成為當前全球果樹栽培發(fā)展的總趨勢.

利用昆蟲病原真菌防治害蟲是生物防治的重要手段,蟲生真菌種類多,具有顯著的流行趨勢,容易大量生產(chǎn),且安全有效,在害蟲生物防治中占有越來越重要的地位.目前關(guān)于病原真菌防治桃小食心蟲的報道較少,陶訓等[2-3]利用白僵菌防治桃小食心蟲,研究了白僵菌寄生桃小食心蟲的生物學特性以及白僵菌與化學殺蟲劑對硫磷微膠囊混用防治桃小食心蟲的室內(nèi)和田間試驗,證明了對桃小食心蟲有很好的防治效果;樊美珍等[4]調(diào)查研究了金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)分生孢子和干菌絲在土壤中的延續(xù)情況及對桃小食心蟲的侵染力,證實綠僵菌控制桃小食心蟲有很好的潛力.

本研究從桃小食心蟲越冬繭的自然染病蟲尸上分離純化得到3株侵染桃小食心蟲的病原真菌,經(jīng)室內(nèi)培養(yǎng)和顯微形態(tài)特征的鑒定,其中兩菌株為鐮孢屬(Fusarium)尖孢鐮孢菌(F.oxysporum),另外一種為擬青霉屬(Paecilomyces)粉質(zhì)擬青霉(P.farinosus),希望能為利用昆蟲病原菌防治桃小食心蟲提供菌種資源和應用依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 桃小食心蟲自然染病蟲尸

2009年3月自山西省襄汾縣景毛鄉(xiāng)蘋果園受蟲害嚴重果樹下表土層里采集到自然染病的桃小食心蟲越冬繭,從繭中將染病的幼蟲剝出,用來培養(yǎng)和分離菌種.

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)[成分及配比:馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、葡萄糖18 g、蒸餾水1 000 m L]

1.1.3 回接試驗的蟲源

用健康的桃小食心蟲幼蟲作為回接試驗昆蟲,2009年9月采集被桃小食心蟲鉆蛀的棗和蘋果,放置于室內(nèi),讓桃小食心蟲幼蟲自然脫果,收集健康蟲體,用于試驗.

1.1.4 儀器和藥品

主要儀器:OL YMPUS BX51顯微鏡及配套的OL YMPUS數(shù)碼相機C-5050 Zoom;DHG-9075A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海益恒實驗儀器有限公司);ZDX-35BI座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);CJ-C系列潔凈工作臺 (上海上凈實業(yè)有限公司).

主要試劑:瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司);葡萄糖(天津市博迪化工有限公司);Tween-80(天津市化學試劑三廠).

1.2 方法

1.2.1 病原真菌的分離和純化

在無菌條件下將受真菌感染的桃小食心蟲蟲尸,每頭剪成3小塊,用70%的酒精浸5 s,再用0.1%汞水消毒3 m in,然后用無菌水沖洗3次,再將蟲尸小塊放入PDA平板培養(yǎng)基中,每一個培養(yǎng)皿內(nèi)放3塊,呈等腰三角形擺放.把裝有蟲尸的培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)室,在25℃下培養(yǎng)3 d,再將培養(yǎng)出的菌株劃線分離.

1.2.2 菌株培養(yǎng)與形態(tài)觀察

將3株純化菌株分別點接于PDA平板培養(yǎng)基上,25℃恒溫培養(yǎng)室培養(yǎng)4 d或5 d,觀察記錄菌落特征,測量菌落直徑.用載片觀察法[5]觀察菌株形態(tài)特征,記錄分生孢子大小、形狀、著生方式及菌絲形態(tài)特點.

將圓形濾紙鋪于培養(yǎng)皿的底部,再放一“U”形玻棒,棒上放一潔凈載玻片,蓋上皿蓋,滅菌后烘干備用.用無菌玻棒直接蘸取已融化的培養(yǎng)基滴于培養(yǎng)皿的載玻片中央.待培養(yǎng)基凝固后用接種環(huán)取少量孢子接種于載玻片上培養(yǎng)基小塊的四周,加上蓋玻片.為防止培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基干燥,在培養(yǎng)皿的濾紙圓片上滴加無菌的飽和氯化鈉溶液3～4 m L,蓋好皿蓋,置25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),定期取出,觀察顯微結(jié)構(gòu)并拍照.

1.2.3 菌種鑒定

根據(jù)形態(tài)學觀察,參照《山西蟲生真菌》[6]以及蒲蟄龍《昆蟲真菌學》[7]來鑒定分離的病原真菌.

1.2.4 孢子懸浮液的制備

將3株病原真菌接種于PDA平板,在70%濕度、25℃恒溫箱中培養(yǎng)10 d,然后用0.5%Tween-80溶液洗脫分生孢子,在顯微鏡下以血球計數(shù)板計數(shù),檢測分生孢子濃度,并將其配置成孢子濃度為5×107m L的懸浮液,為回接試驗使用.

1.2.5 回接試驗

將上述制備成的3株病原真菌孢子懸浮液(孢子濃度5×107個/mL),用移液槍將孢子懸液噴灑到桃小食心蟲幼蟲體表,每頭幼蟲噴灑10μL,將接菌后的幼蟲放在玻璃養(yǎng)蟲缸內(nèi),置于25℃、濕度70%的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng),逐天觀察染菌后的幼蟲的行為、死亡后的癥狀、蟲體表面菌絲和孢子的形態(tài)特征,以確定該菌是否為侵染桃小食心蟲的致病菌.

2 結(jié)果與分析

2.1 自然罹病蟲尸癥狀

2009年3月在山西省襄汾縣景毛鄉(xiāng)蘋果里采集的桃小食心蟲越冬繭剝開后發(fā)現(xiàn)有幾頭桃小蟲尸上有蟲生真菌寄生現(xiàn)象,蟲體表面均有白色菌絲(圖1),蟲體僵硬,其中一頭僵蟲蟲體發(fā)黃,有黑色斑點(圖1A),一頭蟲尸為石灰色(圖1B),另外一頭僵蟲蟲體發(fā)黃(圖1C).

2.2 菌株分離結(jié)果

經(jīng)劃線分離純化得到桃小食心蟲的3株病原真菌,分別編號為 TSL 01、TSL 02、TSL03.

2.3 回接殺蟲試驗結(jié)果

圖1 從山西省襄汾縣蘋果園采集的自然罹病桃小食心蟲Fig.1 Carposina sasakii larvae infected by the entomopathogenic fungus from the soil of the apple orchard at Xiangfen,Shanxi

為了驗證分離得到的3株菌株就是致死桃小食心蟲的病原菌,用上述菌株的孢子懸液(濃度:5×107孢子/m L)分別感染健康的桃小食心蟲.結(jié)果發(fā)現(xiàn),被菌株 TSL 01感染的桃小食心蟲3 d后開始相繼死亡,保濕培養(yǎng)后從蟲體內(nèi)長出白色菌絲,蟲體的體色發(fā)黃,逐漸萎縮干癟(圖2A);被菌株 TSL02感染的桃小食心蟲4 d后開始相繼死亡,死亡時蟲體全身顏色變暗,最后黑紫(圖2B),保濕培養(yǎng)蟲體長出白色菌絲;被菌株TSL 03感染的桃小食心蟲5 d后開始相繼死亡,保濕培養(yǎng)后從蟲體內(nèi)長出白色菌絲(圖2C).在顯微鏡下觀察對比菌絲和孢子的形態(tài)特征,其與開始從桃小食心蟲僵尸上分離純化的3株菌株相同.由此證明,從桃小食心蟲上分離得到的3株菌株是桃小食心蟲的致病菌.

圖2 桃小食心蟲幼蟲被分離菌株感染的癥狀,A:被菌株TSL01感染癥狀;B:被菌株 TSL02感染癥狀;C:被菌株 TSL03感染癥狀.Fig.2 Symp tom of Carposinasasakii larvae infected by the isolated strains of fungi,A:infected by the strain TSL01,B:infected by the strain TSL02 and C:infected by the strain TSL03.

2.4 形態(tài)特征

2.4.1 菌株 TSL01

培養(yǎng)性狀:菌株在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)4 d,菌落較大,直徑40～42 mm,不透明,白色,呈圓形或扁圓形,中央隆起呈帽狀結(jié)構(gòu),邊緣絲狀,較稀疏,向四周呈輻射狀分散(圖3A),氣生菌絲白色,絲絨狀、羊毛狀至氈狀.菌落背面呈淡黃褐色,中央為深黃褐色(圖3B).

形態(tài)特征(圖3C):分生孢子既有大型分生孢子又有小型分生孢子,大型者數(shù)量較多,月牙形,較勻稱,3-5分隔,多數(shù)3分隔,大小為(18.0～34.0)μm×(3.3～4.7)μm;小型者橢圓形、腎形、卵圓形,假頭狀著生,大小為(5.3～12.0)μm×(2.0～3.3)μm;產(chǎn)孢細胞單瓶梗.菌絲透明有隔,輪狀生長.

經(jīng)鑒定,菌株 TSL 01為鐮孢屬尖孢鐮孢.

2.4.2 菌株 TSL 02

培養(yǎng)性狀:菌株在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)4 d,菌落直徑18～20 mm,菌落小,白色,不透明,呈圓形或扁圓形,菌落隆起,成帽狀,表面菌絲致密;菌落邊緣整齊(圖4A).菌落背面初期為白色(圖4B),后期發(fā)黃.

形態(tài)特征:分生孢子梗產(chǎn)自氣生菌絲,光滑透明有分隔;分生孢子梗常為輪生狀小梗,具有幾乎圓柱狀基部和1-3個圓錐狀頂部,多呈“Y”字形狀.分生孢子從圓柱形至梭形,單孢,光滑,大小為(2.0～2.9)μm×(1.5～2.2)μm;分生孢子常連接成近于直立的長鏈,其很少纏結(jié)(圖4C).分生孢子萌發(fā)前膨脹,并伸長,產(chǎn)生1芽管.

經(jīng)鑒定,菌株 TSL 02為擬青霉屬粉質(zhì)擬青霉.

圖3 TSL01菌株培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征,A:菌落正面觀,B:菌落背面觀,C:菌株顯微結(jié)構(gòu).Fig.3 Cultural and morphological characteristics of the strain TSL01,A:The front view of colony,B:The back view of colony,C:Micro-structure of the strain.

圖4 菌株 TSL02培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征,A:菌落正面觀,B:菌落背面觀,C:菌株顯微結(jié)構(gòu)Fig.4 Cultural and morphological characteristics of the strain TSL02,A:The front view of colony,B:The back view of colony,C:Micro-structure of the strain.

2.4.3 菌株 TSL03

培養(yǎng)性狀:菌株在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)5 d,菌落直徑42～47 mm,菌落較大,不透明,呈圓形或扁圓形,中央為臍狀凸起狀,菌落邊緣為絲狀,較稀疏,呈輻射狀,邊緣較扁平(圖5A).菌落背面淡紫色,邊緣白色(圖5B).氣生菌絲白色,生長后期偶有些菌絲為淡紫色,菌絲呈絲絨狀、羊毛狀至氈狀.

形態(tài)特征:分生孢子既有大型分生孢子,又有小型分生孢子,小型孢子量多,大型孢子量很少.小型分生孢子橢圓形、腎形、卵圓形,單生,串生或假頭生,0-1個分隔,孢子中央凹陷,呈血細胞狀,大小為(4.8～17.6)μm×(2.4～4)μm;大型分生孢子紡錘形,或稍彎呈鐮刀形,也凹陷,3-5分隔,一般3個分隔,大小為(30～36)μm×(3.6～4.4)μm;菌絲有隔,每個隔之間一個孢子梗,孢子梗輪生.

經(jīng)鑒定,菌株 TSL 03為鐮孢屬尖孢鐮孢.

圖5 菌株 TSL03培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征,A:菌落正面觀,B:菌落背面觀,C:菌株顯微結(jié)構(gòu)顯示小型分生孢子,D:菌株顯微結(jié)構(gòu)顯示大型分生孢子Fig.5 Cultural and morphological characteristics of the strain TSL03,A:The front view of colony,B:The back view of colony,C:Micro-structure of the strain showing the small conidia,D:Micro-structure of the strain showing the big conidia.

3 討論

本研究從自然染病的桃小食心蟲蟲尸上分離純化出3株蟲生真菌,鑒定結(jié)果顯示菌株 TSL01和菌株TSL 03屬于鐮孢屬尖孢鐮孢菌,菌株 TSL02屬于擬青霉屬粉質(zhì)擬青霉.回接試驗證明它們對桃小食心蟲具有寄生致死作用,是桃小食心蟲病原菌.

蟲生鐮刀菌屬于(鐮孢屬)一類重要昆蟲病原真菌,對其研究始于Webber在1897年對寄生在介殼蟲上鐮刀菌的描述.在南美、北美和南亞國家記錄的有F.coccophilum、F.merismoides、F.larvarum、F.episphaeria、F.stilboides等[8].美國佛羅里達州利用F.coccophilum防治桃樹和柑桔的蚧蟲取得了顯著效果[9].國內(nèi)曾報道過嗜蚧鐮刀菌(F.coccophilum)等10種鐮刀菌可寄生蚧蟲,并對控制蚧蟲種群數(shù)量具有重要作用[10].Sundar等從雌性Culexquinquefasciatus分離出F.pallidoroseum,并發(fā)現(xiàn)這株鐮刀菌對寄主蚊子在7 d的致死率達100%,具有很好的殺蟲效果[11].串珠鐮刀菌(F.moniliforme)和燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)可寄生鱗翅目、同翅目、雙翅目中的許多害蟲,對幼蟲的寄生致死率50%～100%[12].

擬青霉在自然界中分布廣泛,也是國內(nèi)外主要研究和利用的蟲生真菌類群.迄今為止,我國有記載的擬青霉屬蟲生真菌共有16個種或變種[13],研究報道最多的是淡紫擬青霉(P.lilacinus)、粉質(zhì)擬青霉(P.farinosus)和玫煙色擬青霉(P.fumosoroseus).國內(nèi)外利用淡紫擬青霉主要用于防治線蟲,有近70個國家用它來防治根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)、胞囊線蟲(Heteroderasp.)等植物寄生線蟲,并取得了較好的效果[14].武覲文利用粉質(zhì)擬青霉菌劑防治越冬油松毛蟲致死率約為70%[15].玫煙色擬青霉防治害蟲的報道主要有用其防治蚜蟲、煙粉虱、朱砂葉螨和菜青蟲等害蟲[16-19],也有報道利用擬青霉防治小菜娥[20-21].

以上報道可以看出,國內(nèi)外利用鐮刀菌屬和擬青霉屬防治害蟲均有很好的效果.根據(jù)現(xiàn)有記載,鮮見有從桃小食心蟲上分離出鐮孢屬病原菌的報道.日本在1994年從桃小食心蟲上曾分離出玫煙色擬青霉[22],但我國還沒有從桃小食心蟲上分離出擬青霉的報道.因此,本研究分離的3個菌株為開展桃小食心蟲生物防治提供了新的菌種資源,但為了更好地利用這些菌種,應對這些菌株進行超微結(jié)構(gòu)觀察和遺傳分子鑒定是必要的.同時,還應該研究它們的生物學特性和對寄主昆蟲的毒力,為菌株進一步開發(fā)提供科學依據(jù).

[1] 劉玉升,程家安,牟吉元.桃小食心蟲的研究概況[J].山東農(nóng)業(yè)大學學報,1997,28(2):207-214.

[2] 陶訓.白僵菌與對硫磷微膠蠹劑混用防治桃小食心蟲的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學,1990(1):20-22.

[3] 陶訓,馮建國,莊乾營,等.白僵菌防治桃小食心蟲的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學,1994(5):39-42.

[4] 樊美珍,李增智.綠僵菌在土壤中的延續(xù)及控制桃小食心蟲的潛力[J].應用生物態(tài)學報,1996,7(1):49-55.

[5] 沈萍,范秀榮,李廣武.微生物學實驗[M].北京:高等教育出版社,1996:44-45.

[6] 賀運春,張仙紅.山西蟲生真菌[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社,2006.

[7] 蒲哲龍,李增志.昆蟲真菌學[M].合肥:安徽科學技術(shù)出版社,1996.

[8] Shah P A,Pell J K.Entomopathogenic Fungi as Biological Control Agents[J].Appl Microbilo Biotechnol,2003,61:413-423.

[9] 王拱辰,葉琪銘.鐮刀菌在生物防治中的作用[J].生物防治通報,1990,6(2):80-84.

[10] 葉琪銘.昆蟲天敵-蟲生鐮刀菌[J].昆蟲天敵,1989,11(1):5-9.

[11] Mohanty S S,Kamaraju Raghavendra,Usha Rai K,Aditya Prasad Dash A P.Efficacy of FemaleCulex quinquef asciatuswith Entomopathogenic FungusFusarium pallidoroseum[J].Parasitol Res,2008,103:171-174.

[12] 林清洪,黃志宏.鐮刀菌研究概述[J].亞熱帶植物通訊,1996,25(1):51-56.

[13] 唐美君.擬青霉屬蟲生真菌的研究應用概況與展望[J].中國茶葉,2001(3):32-33.

[14] 趙培靜,任文彬,繆承杜,等.淡紫擬青霉研究進展與展望[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2007,35(30):9672-9674,9793.

[15] 武覲文.應用粉擬青霉等真菌防治油松毛蟲[J].林業(yè)科學,1988,24(1):34-40.

[16] Riba G.Combination ap rès Heteroceryose Chezle Champignon EntomopathogenePaecilom yces fumosoroseus[J].Entomophaga,1978,23:417-421.

[17] 張仙紅,嵇能煥.玫煙色擬青霉菌株的毒力測定[J].山西農(nóng)業(yè)大學學報,2006(1):24-26.

[18] 方祺霞,楊淑芳,胡亞梅,等.玫煙色擬青霉北京變種防治溫室白粉虱的研究[J].生物防治通報,1986,2(3):129-131.

[19] Wraight S P,Carruthers R I,Bradley C A,et al.Patheogenicity of the Entomopathogenic FungiPaecilomycesspp.andBeauveria bassianaAgainst the Silver Leaf White fly,Bemisia argentifolii[J].Journal of Invertebrate Pathology,1998,71:217-226.

[20] Altre J A,Uandenberg J D.Facto rs Influencing the Infectivity of Isolates ofPaecilomyces fumosoroseusAgainst Dia-mondback Mo th,Plutella xylostella[J].Journal of Invertebrate Pathology,2001,78:31-36.

[21] 王宏民,張奐,郝赤,等.玫煙色擬青霉對小菜蛾幼蟲的侵染過程及接菌方法對其致病力的影響[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報,2009,17(4):704-708.

[22] 景云飛,張仙紅.昆蟲病原真菌玫煙色擬青霉的研究進展[J].山西農(nóng)業(yè)科學,2007,35(9):19-22.

Isolation and Morphological Identification of Three Strains of Entomopathogenic Fungi of Carposina sasakii

ZHU Yong-min1,LI Jie2,XIONG Qi1,XIE Ying-ping1,XUE Jiao-liang1
(1.School of life Science,Shanxi University,Taiyuan030006,China;
2.Institute of Plant Protection,Shanxi Academy of Agriculture Sciences,Taiyuan030031,China)

Three strains of entomopathogenic fungi designated No.TSL01,No.TSL02 and No.TSL03 were isolated from the natural infected insect,Carposina sasakii(Matsmura)at the apple orchard in Xiangfen,Shanxi,China.These strains were identified as pathogens ofC.sasakiiby reinoculation test,moreover,the cultural and morphological characteristics w ere observed.The results show ed that the m ycelium of three strainswasw hite.Both of the two strains,TSL 01 and TSL 03,had big colonies and could secrete snuffcolored or orchid pigment.Two kinds of conidiophores can be produced from them.The macroconidia was crescent or falciform with separators,w hile the microconidia was oblong,or kidney-shaped and grow s as cephalosporium,and their hyphae also possessed separato rs.The colony of the strain TSL 02 w as relatively small and the pigment was unconspicuous.Its conidiophores,columniform or spindly,arranged in a chain,and the peduncle of the conidiopho res p resented in a“Y”shape.These characteristics indicated that the strain TSL01 and TSL 03 were belong to the genusFusarium oxysporum,and the strain TSL 02 was belong to the genusPaecilomyces farinosus.This is the first record on these kinds of the entomopathogenic fungi fromC.sasakii.

Carposina sasakii(Matsmura);entomopathogenic fungi;morphological identification

S763.42;Q969.42+9.5

A

0253-2395(2011)01-0131-06＊

2010-04-12;

2010-07-16

農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(200803006)

朱永敏(1984-),女,山西臨汾人,碩士研究生,主要研究昆蟲病原真菌與生物防治.E-mail:zhuyongmin11@126.com＊通訊作者:E-mail:xuejl@sxu.edu.cn