＊ 基于m tDNA CO I基因序列的鹽膚木種群遺傳變異

安淼,馬恩波,任竹梅

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006;2.山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所,山西太原 030006)

＊基于m tDNA CO I基因序列的鹽膚木種群遺傳變異

安淼1,馬恩波2,任竹梅1＊

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006;2.山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所,山西太原 030006)

基于m tDNA CO I基因序列對(duì)貴州、湖北和四川的鹽膚木(Rhus chinensisM ill.)種群進(jìn)行遺傳變異分析.研究共測(cè)得鹽膚木9個(gè)種群50個(gè)個(gè)體的m tDNA COI基因長(zhǎng)度為1.37kb的序列,在測(cè)得的序列中有3個(gè)核苷酸位點(diǎn)存在變異(占所測(cè)核苷酸序列的0.22%),T、C、A、G 4種核苷酸的組成分別為34.1%、21.8%、22.5%、21.6%,其中A+T含量(56.6%)高于 G+C含量(43.4%).共檢測(cè)到3個(gè)單倍型(HapA、HapB和 HapC),HapA出現(xiàn)在所有種群中,是出現(xiàn)頻率最高的單倍型,占所測(cè)序列的90%,該單倍型可能是祖先單倍型;HapB由安縣的1個(gè)個(gè)體和竹山的3個(gè)個(gè)體共享,而 HapC只存在于榕江的1個(gè)個(gè)體.分析表明鹽膚木種群具低水平單倍型多樣性(0.000 2)和核苷酸多樣性(0.187 0),基于該基因序列的鹽膚木種群間遺傳多樣性和遺傳分化均較小.

鹽膚木;m tDNA;CO I基因序列;遺傳變異

鹽膚木(Rhus chinensisM ill.)是漆樹(shù)科鹽膚木屬落葉灌木或小喬木,主要分布于東亞溫帶、亞熱帶、熱帶地區(qū),我國(guó)除黑龍江、吉林、內(nèi)蒙、寧夏、青海、新疆等省(區(qū))外均有分布[1],是形成五倍子最主要的寄主植物,又稱“五倍子樹(shù)”,只有貴州、四川、湖北、湖南、陜西、云南和廣西等部分山區(qū)的鹽膚木可見(jiàn)有倍子形成,是具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物[2].目前對(duì)鹽膚木葉片的化學(xué)成分、形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、人工繁殖及育苗技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)等已進(jìn)行了相關(guān)研究[3-6],而有關(guān)鹽膚木種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)方面的研究較少.本課題組利用ISSR技術(shù)對(duì)角倍蚜及其寄主鹽膚木的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)角倍蚜和鹽膚木種群具有相同的基因流模式,但其遺傳距離不具有相關(guān)性[7].用DNA序列作為分子標(biāo)記進(jìn)行鹽膚木種群遺傳多樣性方面的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道.鑒于此,本研究以鹽膚木mtDNA CO I基因序列作為分子標(biāo)記,分析有角倍形成的幾個(gè)鹽膚木種群之間的遺傳變異、單倍型分布、遺傳多樣性及其遺傳結(jié)構(gòu)等,為深入研究其分子進(jìn)化及其與角倍蚜之間的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系提供分子生物學(xué)方面的資料,同時(shí)可為更好的保護(hù)和合理利用這一生物資源提供科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

鹽膚木樣本均采自野外自然種群,采集的葉片材料用硅膠干燥保存.樣本信息分別見(jiàn)表1(P128).

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與擴(kuò)增

采用改進(jìn)的CTAB法[8]提取鹽膚木樣本基因組DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),測(cè)定不同波長(zhǎng)下的紫外吸收值(OD值),確定其濃度并估計(jì)其純度.

建立 PCR反應(yīng)體系,每50μL體系中包含1×Buffer,2.5 mmol·L-1M g2+,0.25 mmol·L-1dN TPs,0.4μmol·L-1每條引物,1.5UTaqDNA聚合酶,2μL(含30～50 ngDNA)模板溶液.反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 m in,94℃變性30 s,50℃退火40 s,72℃延伸2 min,40個(gè)循環(huán)后,72℃延伸7 m in.PCR反應(yīng)在MJ公司PTC-200基因擴(kuò)增儀上完成,擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其大小、純度及亮度.擴(kuò)增引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成,序列分別為:

引物 1:5’-TAA TGGGCACA TGCTTTTCAGT-3’,

引物 2:5’-A GTA GTAA TGAAAA GCTGGAGGGCTT-3’.

表1 本研究鹽膚木樣本采集信息Table 1 Sampling sites of Rhus chinensis M ill

1.2.2 PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序

對(duì)于擴(kuò)增效果良好且足量的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京博邁德公司)進(jìn)行純化,純化后的樣品委托北京博邁德生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序.

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

得到的序列用Sequencher4.8軟件進(jìn)行編輯,剪切掉引物部分,經(jīng)過(guò)核對(duì)校正得到的序列用Clustal X 1.83[9]進(jìn)行排序、比較;應(yīng)用DnaSP4.0軟件[10]統(tǒng)計(jì)序列的單倍型,計(jì)算平均核苷酸差異、核苷酸多樣性和單倍型多樣性等;應(yīng)用Mega4.0[11]計(jì)算核苷酸使用頻率和堿基組成等.

2 結(jié)果與分析

2.1 序列組成及變異

共得到鹽膚木9個(gè)種群50個(gè)個(gè)體的m tDNA CO I基因序列,通過(guò)校對(duì)排序比較分析,結(jié)果獲得CO I基因序列長(zhǎng)1.37 kb,共檢測(cè)到3個(gè)變異位點(diǎn),全部為單一信息位點(diǎn),約占分析位點(diǎn)總數(shù)的0.22%,分布于840、870和1313位.其中2個(gè)變異發(fā)生在密碼子的第3位點(diǎn)上,占66.7%,1個(gè)在第1位點(diǎn),第2位點(diǎn)無(wú)變異位點(diǎn).其中 T、C、A和 G 4種核苷酸的平均比例分別為34.1%、21.8%、22.5%和21.6%,A+T平均含量為56.6%,G+C含量為43.4%,A+T的含量高于 G+C含量,但是它們之間的差異明顯低于昆蟲(chóng)中m tDNA基因核苷酸組成比例,昆蟲(chóng)具有較高的A+T含量[12-14].

2.2 單倍型分布

序列分析結(jié)果顯示,鹽膚木50個(gè)m tDNA CO I基因序列共產(chǎn)生3個(gè)單倍型:HapA、HapB和 HapC,它們之間只存在位點(diǎn)多態(tài)性,HapA與 HapB差異不大,僅在1313位點(diǎn)有1個(gè)堿基的替換(G?A),HapA與HapC在840和869位點(diǎn)各有1個(gè)堿基的替換(C?T),HapB與 HapC差異相對(duì)較大,二者之間有3個(gè)堿基的替換,分別在840、869(C?T)以及1313位點(diǎn)(G?A).HapA存在于所有種群中,可能是祖先單倍型,HapB存在于湖北竹山和四川安縣種群的4個(gè)個(gè)體中,且在竹山種群中出現(xiàn)的幾率較高(75%),HapC只有貴州榕江種群的1個(gè)個(gè)體.獨(dú)享單倍型的存在,在一定程度上表明鹽膚木種群存在著微弱的遺傳變異和分化.

2.3 遺傳多樣性

統(tǒng)計(jì)鹽膚木種群的單倍型和核苷酸多樣性(表2).可見(jiàn),3種單倍型出現(xiàn)的頻率分別是 HapA=0.900、HapB=0.080和 HapC=0.020.種群總核苷酸多樣性為0.000 2,單倍型多樣性為0.187 0.其中四川種群的核苷酸多樣性為0.000 1,單倍型多樣性為0.118 0;湖北種群的核苷酸多樣性為0.000 3,單倍型多樣性為0.385 0;貴州種群的核苷酸多樣性為0.000 2,單倍型多樣性為0.100 0,說(shuō)明鹽膚木種群CO I基因的遺傳變異很低.

表2 鹽膚木種群遺傳多樣性Table 2 Genetic diversity of R.chinensis Mill populations based on CO Isequences

3 討論

遺傳多樣性是物種長(zhǎng)期進(jìn)化的產(chǎn)物.物種或種群進(jìn)化潛力和適應(yīng)環(huán)境的能力取決于遺傳多樣性的大小;一個(gè)種群遺傳多樣性越高或越豐富,適應(yīng)環(huán)境的能力就越強(qiáng),越容易擴(kuò)展其分布范圍和開(kāi)拓新的環(huán)境[15-16].本研究基于m tDNA CO I基因序列對(duì)鹽膚木種群遺傳多樣性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示其單倍型的多樣性和核苷酸的多樣性均較低.在所測(cè)的50條序列中共檢測(cè)到3個(gè)變異位點(diǎn),出現(xiàn)3個(gè)單倍型,單倍型HapA為鹽膚木所有種群的共享單倍型,說(shuō)明它是一種較為穩(wěn)定的單倍型,很有可能為祖先單倍型.單倍型 HapB為四川安縣和湖北竹山種群共享單倍型,單倍型 HapC只存在于貴州榕江種群且只有1個(gè),說(shuō)明鹽膚木種群在m tDNA CO I基因上存在微弱的遺傳分化.

CO I基因作為一種有效的分子標(biāo)記,主要應(yīng)用在動(dòng)物,特別是用于昆蟲(chóng)的系統(tǒng)進(jìn)化研究中.有資料表明,由于m tDNA基因序列的高度保守性和結(jié)構(gòu)上極高的重排率以及低的突變率等,植物m tDNA的進(jìn)化速率比較緩慢[17].

本研究選擇CO I基因作為分子標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)該基因的遺傳多樣性較低,還不足以探明鹽膚木種群之間的分化,研究結(jié)果也說(shuō)明CO I基因序列作為植物種群遺傳多態(tài)性研究的局限性.葉綠體基因組在植物分子系統(tǒng)學(xué)研究中使用較為廣泛,因?yàn)槿~綠體比線粒體進(jìn)化速率更快,對(duì)于經(jīng)歷過(guò)快速進(jìn)化的種群具有較高的分辨率[18],而且葉綠體具有同線粒體一樣的優(yōu)點(diǎn)如母系遺傳、多拷貝等,將來(lái)需結(jié)合葉綠體基因?qū)}膚木種群遺傳多樣性進(jìn)行更深入的探討.加之部分種群標(biāo)本數(shù)量的限制,在一定程度上影響其結(jié)果分析的代表性,這可能是導(dǎo)致鹽膚木種群CO I基因遺傳多樣性低的因素之一.

鹽膚木為五倍子蚜主要種類—角倍蚜的唯一夏寄主植物,為了研究二者之間的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系,本研究在五倍子分布區(qū)采集標(biāo)本,試圖采用同樣的序列分子標(biāo)記基因CO I進(jìn)行研究,初步的結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物線粒體DNA基因的變異與蚜蟲(chóng)相應(yīng)基因的變異相比很小,在進(jìn)一步的研究中應(yīng)選擇進(jìn)化速率較快的葉綠體DNA基因序列或其他分子標(biāo)記方法,同時(shí)增加種群和個(gè)體數(shù)量進(jìn)行分析,為深入研究其分子進(jìn)化及其與角倍蚜之間的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系提供分子生物學(xué)方面的資料,同時(shí)可為更好的保護(hù)和合理利用這一生物資源提供理論基礎(chǔ).

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Genetic Variation of Rhus chinensis Populations Based on mtDNA COI Sequences

AN Miao1,MA En-bo2,REN Zhu-mei1
(1.School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan030006,China;
2.Research Institute of A p p lied Biology,Shanxi University,Taiyuan030006,China)

Mitochondrial DNA(mtDNA)cytochrome coxidase I(COI)gene was used to exmaine the genetic structure and diversity of aRhus chinensispopulations from China.The sequences(1.37 kb in length)w ere obtained from 50 individuals of the 9R.chinensispopulations.In all the sequences,3 nucleotide site substitutions and 3 hap lotypes(HapA,HapB and HapC)w ere examined,respectively.The base compositions were calculated and the results were:T,34.1%;C,21.8%;A,22.5%and G 21.6%,respectively.The average A+T content was 56.6%w hich was a little higher than G+C content.The low hap lotype diversity(0.187 0)and nucleotide diversity(0.000 2)were detected in this species.Hap A w as shared with about 90.0%of the total individuals,which might be the ancestral hap lotype.HapB was shared with three individuals from Zhushan population and one individual from Anxian population.HapC was examined in one individual of Rongjiang population.The results showed the low genetic diversity and genetic differentiation among theR.chinensispopulations.

Rhus chinensis;m tDNA;CO Igene sequence;genetic diversity

Q349

A

0253-2395(2011)01-0127-04＊

2010-05-10;

2010-08-24

國(guó)家自然科學(xué)基金(30670361);山西省自然科學(xué)基金(2007011078);山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目

安淼(1986-),男,山西太原人,碩士研究生.＊通訊作者:E-mail:zm ren@sxu.edu.cn