＊ ApoCopC與Cu(Ⅱ)相互作用的電化學(xué)研究

張輝,鄭曉艷,田燕妮,楊斌盛

(山西大學(xué)分子科學(xué)研究所化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西太原 030006)

＊ApoCopC與Cu(Ⅱ)相互作用的電化學(xué)研究

張輝,鄭曉艷,田燕妮＊,楊斌盛

(山西大學(xué)分子科學(xué)研究所化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西太原 030006)

ApoCopC自組裝修飾到金電極上,利用循環(huán)伏安法研究了apoCopC與Cu(Ⅱ)的相互作用.發(fā)現(xiàn)Cu(Ⅱ)在apoCopC/Au電極上出現(xiàn)氧化還原峰,氧化和還原峰電位分別位于0.29 V和0.09 V,形式電位E0′為0.19 V,與裸Au電極相比,峰位發(fā)生明顯位移.這表明apoCopC吸附在電極表面并且Cu(Ⅱ)與apoCopC結(jié)合生成配合物.研究了掃描速率、不同濃度下,Cu(Ⅱ)在apoCopC修飾的金電極上的循環(huán)伏安行為.計(jì)算出Cu(Ⅱ)在apoCopC修飾的金電極上的表面電子傳遞系數(shù)α=0.5,電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)ks=0.75 s-1.

apoCopC;Cu(Ⅱ);循環(huán)伏安

銅是生物體必需的微量元素之一,在機(jī)體生理活動(dòng)中起著重要的作用.然而過量銅對生物體是十分有害的[1].因此,細(xì)胞內(nèi)銅的平衡調(diào)節(jié)具有重要的生理意義.

CopC是由102個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的可溶性膜間蛋白,是假單胞菌體內(nèi)銅調(diào)控蛋白之一.NMR、EXAFS和X-ray結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表明:CopC蛋白在溶液中呈現(xiàn)由9股β折疊圍成的桶狀結(jié)構(gòu),在相距約為30?的N端和C端分別具有Cu(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)結(jié)合位點(diǎn),銅離子通過氧化態(tài)的改變實(shí)現(xiàn)在兩個(gè)位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移[2-4].到目前為止,研究apoCopC與Cu(Ⅱ)作用,廣泛使用的方法是紫外、熒光、EXAFS、NMR等,用電化學(xué)方法研究二者作用鮮見報(bào)道.本文利用循環(huán)伏安法(CV)研究apoCopC與Cu(Ⅱ)的相互作用.同時(shí)測定了電子傳遞系數(shù)和電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CH I660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司),金電極為工作電極,鉑絲為對電極,飽和甘汞電極為參比電極(vs SCE);KQ118型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)等.

N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、二水氯化銅等均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.

1.2 蛋白的表達(dá)及濃度測定

ApoCopC經(jīng)誘導(dǎo)、表達(dá)以及純化[5-6].濃度由預(yù)測的摩爾消光系數(shù)ε280=6 970 L·mol-1·cm-1測定.本文所用的apoCopC蛋白濃度經(jīng)測定為2.6×10-4mol/L,由楊斌盛研究小組提供.

1.3 修飾電極的預(yù)處理及制備

先將金電極依次在0.3μm,0.05μm的氧化鋁上拋光,然后用雙蒸水超聲清洗5 min,接著在1 mol·L-1硫酸溶液中,在0～1.5 V的范圍內(nèi),重復(fù)掃描至循環(huán)伏安結(jié)果不再改變.取出金電極用雙蒸水沖洗,并用N2吹干.隨后用微量進(jìn)樣器取6μL apoCopC,均勻地涂布于電極表面.自然干燥后,用緩沖液沖洗以除去未吸附的apoCopC.制備好的電極即為apoCopC/Au電極.所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng):裸金電極或apoCopC/A u電極為工作電極,飽和甘汞電極(SCE)與鉑絲分別作為參比電極和對電極.將制備好的修飾電極浸泡在Cu(Ⅱ)溶液中,攪拌自然富集5 min,取出后用緩沖液沖洗,然后放入p H 7.4的空白 HEPES緩沖溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描.掃描電位范圍為-0.25～0.6 V.測試底液通高純氮?dú)?5 min除氧,并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持氮?dú)鈿夥?

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu2+在apoCopC/Au上的電化學(xué)行為

圖1(a)是0.3 mmol·L-1Cu2+(p H7.4的10 mmol·L-1HEPES緩沖液)在裸Au電極上的循環(huán)伏安響應(yīng).(b)和(c)分別是apoCopC/Au電極無Cu2+和自然富集0.3 mmol·L-1的Cu2+5 min之后,在p H7.4的10 mmol·L-1HEPES緩沖溶液中的循環(huán)伏安響應(yīng).由圖1可以看出,在apoCopC/Au電極上,無Cu2+時(shí),沒有峰出現(xiàn).富集Cu2+后,出現(xiàn)氧化還原峰,氧化和還原峰電位分別位于0.29 V和0.09 V,形式電位E0′為0.19 V,與裸Au電極相比,峰位發(fā)生明顯位移.這些電化學(xué)行為表明,apoCopC修飾在金電極上并且Cu2+與apoCopC結(jié)合生成Cu2+-CopC配合物.

圖1 循環(huán)伏安響應(yīng).a:裸金電極在Cu2+溶液中;b:apoCopC修飾的金電極在 HEPES緩沖溶液中;c:apoCopC修飾金電極富集Cu2+5 min后在 HEPES緩沖溶液中.掃描速率:100 m V/sFig.1 Cyclic voltammogram s of bare Au electrode in Cu2+solution(a),apoCopC modified Au electrode prior to(b)and after(c)Cu2+accumulation for 5 min in 10 mM HEPES buffer,(p H 7.4),at scan rate of 100 m V/s

2.2 掃描速率對Cu2+在apoCopC/Au電極上峰電流的影響

圖2(P120)為不同掃速時(shí)Cu2+在apoCopC/Au電極上的循環(huán)伏安曲線.由圖可見,峰電流隨著掃描速率的增大而增大,并與掃描速率呈線性關(guān)系.線性回歸方程分別為:ipa=1.356 7×10-5v-1.126 36×10-7(r=0.998 87);ipc=8.302 41×10-6v+7.789 63×10-8(r=0.995 76).說明 Cu2+在apoCopC/Au電極上的氧化還原反應(yīng)是表面控制過程.

2.3 電子轉(zhuǎn)移系數(shù)(α)和電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)(ks)的獲得

通過考察峰電位隨掃速變化獲得電極反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)的信息,根據(jù)Laviron公式[7],由峰電位Ep與lgv作圖,根據(jù)其斜率,求得電子轉(zhuǎn)移系數(shù)α=0.5.由以下公式可求電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)ks:

當(dāng)v=300 mV/s,ΔE=211 mV,T=298 K時(shí) ,可求得ks=0.75 s-1.

2.4 不同濃度Cu2+在apoCopC/Au電極上的循環(huán)伏安響應(yīng)

Cu2+在apoCopC/Au上的還原峰電流與其濃度的關(guān)系如圖3(P120)所示.隨著Cu2+濃度的增大,峰電流逐漸增大趨于穩(wěn)定.這是因?yàn)樵陔姌O表面apoCopC與Cu2+結(jié)合,導(dǎo)致蛋白結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和.

2.5 修飾電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

不同時(shí)間制備5片apoCopC/Au修飾電極,在0.3 mmol/L Cu2+溶液中峰電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3%,說明修飾電極重現(xiàn)性較好.修飾電極在緩沖溶液中貯存9 d后,保持59%的初始電流響應(yīng).

圖2 不同掃速下富集Cu2+在apoCopC/Au電極上的循環(huán)伏安曲線.掃描速率:5～100 mV/s.插入圖:峰電流與掃描速率的線性關(guān)系.Fig.2 Cyclic voltammograms of Cu2+accumulation at apoCopC/Au electrode with different scan rates of 5～100 m V/s.Inset:plot of Ip vs.v

圖3 Cu2+在apoCopC/Au電極上還原峰電流與其濃度的關(guān)系(p H7.4的10 mmol/L HEPES緩沖液.掃描速率:100 m V/s)Fig.3 Dependence of the reduction peak currentsof Cu2+on different concentration(10 mmol/L HEPES buffer p H 7.4,at scan rate of 100 m V/s)

3 結(jié)論

本文將apoCopC自組裝修飾于金電極表面,利用循環(huán)伏安法研究了apoCopC與Cu(Ⅱ)相互作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,apoCopC能修飾在金電極上而且Cu2+與apoCopC結(jié)合生成Cu2+-CopC配合物.計(jì)算電子轉(zhuǎn)移系數(shù)α=0.5,電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)ks=0.75 s-1,從而為進(jìn)一步探究CopC蛋白內(nèi)Cu(Ⅱ)的運(yùn)輸機(jī)理以及細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)蛋白的抗銅作用提供一些有用的理論基礎(chǔ).

[1] Pena M M O,Lee J,Thiele D J.Critical Review a Delicate Balance:Homeostatic Control of Copper Up take and Distribution[J].J N utr,1999,129:1251-1260.

[2] Amesano F,Banci L,Bertini I,et al.Solution Structure of CopC:A Cup redoxin-like Protein Involved in Copper Homeostasis[J].Structure,2002,10:1337-1347.

[3] Amesano F,Banci L,Bertini I,et al.A Redox Switch in CopC:An Intriguing Copper Trafficking Protein that Binds Copper(Ⅰ)and Copper(Ⅱ)at Different Sites[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(7):3814-3819.

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[6] Li H Q,Zhao Y Q,Zheng X Y,et a l.Fluorescence Spectra Study the Perturbations of CopC Native Fold by 2-p-toluidinynaphthalene-6-sulfonate[J].Spectrochim Acta A,2009,70:56-60.

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Electrochem ical Characteristics on In teraction between ApoCopC and Cu(Ⅱ)

ZHANG Hui,ZHENG Xiao-yan,TIAN Yan-ni,YANGBin-sheng
(Institute of M olecular Science,Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education Shanxi University,Taiyuan030006,China)

A protein monolayermodified electrode w as prepared by the self-assembly of apoCopC at a gold electrode.The interaction of apoCopC with Cu(Ⅱ)was investigated by cyclic voltammetry at apoCopC-modified gold electrode.The results indicated that the oxidation peak and reduction peak of Cu(Ⅱ)at apoCopC-modified gold electrodewere at 0.29 V and 0.09 V,respectively,in which the formal potential was 0.19 V.The peak potentials of Cu(Ⅱ)at apoCopC-modified electrode were shifted evidently comparing with that at the bare gold electrode.These indicated that apoCopC could adsorb on the electrode firm ly and Cu(Ⅱ)bound to apoCopC to fo rm a comp lex.Moreover,the effects of scan rate,different concentration on the voltammetric behavior of Cu(II)on the apoCopC/Au electrode were studied,and the electron transfer coefficient(α)w as 0.5,electron transfer rate constant(ks)w as 0.75 s-1.

ApoCopC;Cu(Ⅱ);cyclic voltammetry

O657.1

A

0253-2395(2011)01-0118-04＊

2010-07-16;

2010-09-09

山西省回國留學(xué)基金;山西省自然科學(xué)基金(2006011016);國家自然科學(xué)基金(20771068)

張輝(1983-),男,山西運(yùn)城人,碩士研究生,從事生物電化學(xué)的研究.＊通訊聯(lián)系人:田燕妮,E-mail:tianyann@sxu.edu.cn