小擬南芥Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆及生物信息學(xué)分析

院海英，顧超，徐芳，崔百明，黃先忠

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003）

鹽脅迫是自然界中主要的非生物脅迫之一，土壤中高濃度的Na＋對(duì)許多高等植物都造成很大的傷害，嚴(yán)重影響著植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。據(jù)聯(lián)合國(guó)科教文組織和糧農(nóng)組織不完全統(tǒng)計(jì)，全世界鹽堿地面積約有9．5438億hm2，占所有陸地面積的7%。在15億hm2可耕地中800萬(wàn)hm2受到鹽的危害，約占所有可耕地面積的6%。其中，我國(guó)的鹽堿土地面積有9913萬(wàn)hm2，占世界鹽堿土壤的1／9［1］。更關(guān)鍵的是，由于化肥的大量使用和不合理的灌溉，鹽漬化程度正在加劇，嚴(yán)重威脅著人類耐以生存的非常有限的土地資源。土壤中高濃度鹽是造成全世界許多農(nóng)作物大幅度減產(chǎn)的重要原因之一。

高鹽環(huán)境是影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育的主要環(huán)境因子之一。為了能夠適應(yīng)高鹽環(huán)境，植物在進(jìn)化過(guò)程中，演化出3種機(jī)制來(lái)阻止過(guò)多的Na＋在胞液中的積累，包括：降低Na＋的吸收、Na＋的外排和Na＋的區(qū)隔化，并控制其長(zhǎng)距離運(yùn)輸至地上部分［2－3］。目前Na＋吸收過(guò)程還不十分清楚，但Na＋的外排和區(qū)隔化是間接的主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程，主要由Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)完成。Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與植物耐逆密切相關(guān)，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注，成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)之一，其利用質(zhì)膜 H＋－ATPase或液泡膜 H＋－ATPase及H＋－PPase泵H＋產(chǎn)生的驅(qū)動(dòng)力把Na＋排出細(xì)胞或?qū)⑵鋮^(qū)隔化入液泡中以消除Na＋的毒害［4－6］。近年來(lái)，人們對(duì)植物耐鹽的分子機(jī)制的研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展。但是，植物的耐鹽性是一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題，也存在很多的問(wèn)題需要進(jìn)一步闡明。所以，對(duì)植物耐鹽性的進(jìn)一步探索，還需從更多的鹽生植物著手，挖掘更多的耐鹽相關(guān)基因，才能真正從細(xì)胞、組織和整體水平上闡明植物鹽脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，從而為植物的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

新疆小擬南芥（Arabidopsis thaliana）是新疆特殊生境下廣泛分布的植物之一。雖然和擬南芥（Arabidopsis thaliana）有很多相似之處，但二者生長(zhǎng)的環(huán)境有很大差異［7］。近年來(lái)對(duì)小擬南芥耐鹽生物學(xué)特性進(jìn)行初步的研究，發(fā)現(xiàn)小擬南芥適應(yīng)于新疆特殊環(huán)境，具有耐受高濃度NaCl脅迫的特性［8－9］，通過(guò)同源克隆法先后從小擬南芥中克隆了一些耐逆基因［10－12］。本研究通過(guò)同源克隆的方法從小擬南芥克隆了1個(gè)液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因完整開放閱讀框cDNA，并利用一系列生物信息學(xué)軟件分析該蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、跨膜特性、系統(tǒng)進(jìn)化等，構(gòu)建植物過(guò)量表達(dá)載體，以期為進(jìn)一步研究該基因的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 植物材料

小擬南芥（Arabidopsis pumila）和擬南芥Col－0（Arabidopsis thaliana）種子為本實(shí)驗(yàn)室保存。種子發(fā)芽培養(yǎng)基為1／2MS固體培養(yǎng)基。其成分：1%葡萄糖（Glucose），2．2g／L MS鹽（Murashige ＆SkooG MEDIUM）（Duchefa Biochemie，Netherland），0．05%2－嗎啉乙磺酸（MES）（Amresco，A－merica），0．8%瓊脂粉（Agar），pH 5．8。

1．1．2 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌GV3101、植物過(guò)量表達(dá)載體pCAMBIA2300－35S為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1．2 方法

1．2．1 小擬南芥的培養(yǎng)

在超凈臺(tái)上先用70%的酒精洗滌種子1min，然后用20%Bleach滅菌處理10min。用無(wú)菌水洗4～5次，每次充分振蕩混勻。將小擬南芥種子在4°C下處理3－4d。均勻地將種子播撒在1／2MS平板上，放置于16h光照和8h黑暗的光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1周后，于2～3片真葉期，移栽到含有蛭石和營(yíng)養(yǎng)土（1∶1）的盆缽中，之后放置到同樣16h光照和8h黑暗的光照培養(yǎng)間里培養(yǎng)。將幼苗移栽至土里生長(zhǎng)1周后，以200mmol／L的NaCl于早晨10：00從根部澆灌進(jìn)行脅迫處理12h，每4h澆灌1次，晚上22：00收集材料，將收獲的葉片迅速置于液氮中冷凍，－80℃冰箱保存以備用。

1．2．2 RNA的提取和cDNA的合成

總RNA的提取采用TIANGEN公司的RNA prep pure Plant Kit試劑盒（離心柱型），參照說(shuō)明書提取。cDNA模板第一鏈的制備，根據(jù)Promega公司M－MLV Reverse Transcriptase合成。

1．2．3 引物的設(shè)計(jì)及合成

為了擴(kuò)增小擬南芥液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHX1，根據(jù)植物中已經(jīng)發(fā)表的基因序列，設(shè)計(jì) 引 物 ApNHX1F4：5′－ATGTTGGATTCTCTAGTGTCGAAAC－3′和 引 物 ApNHX1R4：5′－ATGTTGGATTCTCTAGTGTCGAAAC－3′用作PCR擴(kuò)增。

1．2．4 基因的克隆和序列分析

RT－PCR擴(kuò)增時(shí)，以葉片的cDNA為模板，在50μL的反應(yīng)體系中加入上述cDNA模板2μL，5 μL 10×Ex Taq Buffer，dNTP 各0．2mmol／L，正反向引物各5nmol，1UEx Taq DNA聚合酶（TaKaRa），ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，2min，后94℃45s，56℃45s，72℃2min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)，割下目的條帶，利用凝膠回收試劑盒（promega）純化后，將回收產(chǎn)物連接到載體pMD18－T上（TaKaRa）。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在涂有IPTG／X－gal及氨芐抗生素的LB平板上通過(guò)藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性克隆于LB培養(yǎng)基中過(guò)夜搖菌，小量提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒交由北京華大基因公司測(cè)序，構(gòu)建成pMD18－T：：ApNHX1。

1．2．5 序列分析和進(jìn)化樹構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果利用DNAstar軟件分析載體及引物序列，在 NCBI（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov）中下載相關(guān)的NHX1蛋白序列，利用 MEGA 4．1（molecular evolutionary genetics analysis，version 4．1）軟件進(jìn)行所有已知NHX1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析，蛋白序列比對(duì)利用Clustal W程序進(jìn)行，進(jìn)化樹利用Neighbor－Joining方法構(gòu)建，其中進(jìn)行1000次Bootstrap分析，以使得分枝的結(jié)果更可靠［13］。

蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)利用GenBank上的blastp軟件 （http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／blasp）；蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)用 ProtParam （http：／／www．expasy．ch／tools／protparam．html）分析；蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu) 預(yù) 測(cè) 用 SOPMA （http：／／npsa－pbil．ibcp．fr／cgi－bin／npsa＿automat．pl？page＝／NPSA／npsa＿sopma．html）軟件；蛋白氨基酸序列的疏水性／親水性 分 析 用 ProtScale（http：／／expasy．org／tools／protscale．html）分析。

1．2．6 過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建

測(cè)序正確的質(zhì)粒pMD18－T：：ApNHX1，用BamHⅠ和XbaⅠ酶切回收目的片段，同時(shí)用同樣的雙酶切pCAMBIA2300－CaMV35S－OCS載體回收質(zhì)粒大片段，經(jīng)T4連接酶（TaKaRa）連接后，將連接產(chǎn)物p35S：：ApNHX1經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。

鑒定正確的質(zhì)粒，用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的單克隆保存菌液。

2 結(jié)果與分析

2．1 ApNHX1基因的克隆與測(cè)序

新疆小擬南芥的種子采自于石河子周邊，發(fā)現(xiàn)其生活的環(huán)境與擬南芥不盡相同。

在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行了萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，首先將擬南芥和小擬南芥的種子播種在1／2MS培養(yǎng)基上分別萌發(fā)，生長(zhǎng)1周后將幼苗轉(zhuǎn)入含200mmol／L NaCl的1／2MS培養(yǎng)基上中培養(yǎng)3d后，發(fā)現(xiàn)擬南芥已經(jīng)全部白化死亡，而小擬南芥依然正常生長(zhǎng)（圖1），這說(shuō)明小擬南芥具有一定的耐鹽能力，將此時(shí)的小擬南芥的幼苗收集起來(lái)，經(jīng)液氮研磨，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為RT－PCR反應(yīng)的模板。

圖1 200mmol／L NaCl對(duì)擬南芥和小擬南芥幼苗生長(zhǎng)的影響Fig．1Comparison of shoot growth of Arabidopsis thaliana and Arabidopsis pumila on 200mmol／L NaCl

利用引物組合ApNHX1F4和ApNHX1R4，擴(kuò)增出了約1．6kb的產(chǎn)物（圖2A），將此PCR產(chǎn)物回收純化后連接到pMD18－T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定（圖2B），獲得陽(yáng)性克隆pMD18－T：：ApNHX1。

挑選其中3號(hào)克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAstar軟件分析，發(fā)現(xiàn)該序列包含全部的編碼區(qū)序列，全長(zhǎng)1617bp，推測(cè)編碼538個(gè)氨基酸的多肽，將該基因命名為ApNHX1（GenBanK 登錄號(hào)：JF357965）。同擬南芥的AtNHX1蛋白氨基酸比對(duì)分析表明相似性可達(dá)99%，二者只有2個(gè)氨基酸的不同（圖3）。

在ApNHX1中105位是半胱氨酸C（Cysterine），而 AtNHX1是精氨酸 R （Arginine），ApNHX1的130位的甘氨酸A（Alanine），而AtNHX1為蘇氨酸T（Threonine）。這2個(gè)氨基酸主要在第4的跨膜區(qū) TM4。與 AtNHX1、AtNHX2、AlNHX1、ThNHX1、BnNHX1、LeNHX1、GhNHX1、HvNHX2、OsNHX1、TaNHX1蛋白相同位置氨基酸的比較結(jié)果（圖3），表明105位的C是小擬南芥特有的，130的A在11個(gè)蛋白中也不盡相同，暗示著這2個(gè)氨基酸可能起著重要的作用。由比對(duì)結(jié)果來(lái)看，在該跨膜區(qū)段11個(gè)NHX1蛋白的氨基酸具有很高的相似性。并且LFFIYLLPPI序列是高度保守的，這一區(qū)段被認(rèn)為是Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性阻遏物氨氯吡嗪脒（amiloride）的結(jié)合位點(diǎn)［2，6］。

圖2 新疆小擬南芥ApNHX1基因的擴(kuò)增與酶切鑒定Fig．2PCR amplification of ApNHX1 （A）and identification of pMD18－T：：ApNHX1by restriction enzyme cut（B）

圖3 11個(gè)ApNHX1基因蛋白序列的保守區(qū)比對(duì)分析Fig．3Alignment of conserved domain of ApNHX1 proteins from 11different plant species

2．2 ApNHX1的序列特征分析

在NCBI上對(duì)ApNHX1蛋白保守域分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)和擬南芥的有明顯不同（圖4），缺少了擬南芥的kefB保守域［14］，該結(jié)構(gòu)域是K＋轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。b＿cpa1、NhaP和a＿cap1結(jié)構(gòu)域是無(wú)機(jī)離子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；Na＿H＿Exchanger是Na＋／H＋交換體家族；COG3263是NhaP的一種類型；PRK05326是K＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

圖4 新疆小擬南芥ApNHX1蛋白的結(jié)構(gòu)域Fig．4Conserved domain of ApNHX1protein

用ProtParam分析軟件對(duì)ApNHX1編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。推測(cè)該蛋白的分子式為C2734H4243N677O752S25，分子量是59430．3Da，等電點(diǎn)PI 6．56。理論推導(dǎo)其半衰期分別為：30h（體外，哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)）；大于20h（體內(nèi)，酵母細(xì)胞內(nèi)）；大于10h（體內(nèi)，大腸桿菌）。不穩(wěn)定參數(shù)是32．7，屬于穩(wěn)定蛋白。

通過(guò)SOPMA預(yù)測(cè)ApNHX1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖未列出），表明該蛋白的氨基酸序列中，共有α－螺旋（Alpha helix）259處，占二級(jí)結(jié)構(gòu)的48．14%，延伸鏈（Extended strand）866處，占總二級(jí)結(jié)構(gòu)的15．99%，β－轉(zhuǎn)角（Beta turn）22 處，占二級(jí)結(jié)構(gòu)的4．09%；無(wú)規(guī)卷曲（Random coil）81處，占二級(jí)結(jié)構(gòu)的31．78%。

用ProtScale預(yù)測(cè)ApNHX1蛋白氨基酸序列的疏水性／親水性的結(jié)果表明，多肽鏈第372位的絲氨酸S（Serine）具有最低的分值－2．444，第31位的半胱氨酸C（Cysteine）具有最高的分值3．233（圖5）。依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)和分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律，可以看出，在第372位的Ser親水性最強(qiáng)，第31位的Cys疏水性最強(qiáng)，而就整體來(lái)看，疏水性氨基酸均勻分布在整個(gè)肽鏈中，且多于親水性氨基酸。因此，整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為疏水性，沒(méi)有明顯的親水區(qū)域，可認(rèn)為小擬南芥Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是疏水性蛋白，這說(shuō)明該逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白符合跨膜蛋白的特征。

圖5 小擬南芥Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ApNHX1的疏水性／親水性預(yù)測(cè)Fig．5Predicted hydrophobicity／hydrophilic for Na＋／H＋antiporter from Arabidopsis pumila

2．3 NHX1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

高等植物的Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因最早是從擬南芥中克隆的［15］，后來(lái)陸續(xù)在至少在50種以上的植物中分離到了該同源基因。比較這些基因編碼的氨基酸序列，相似性很高，最高可達(dá)90%以上。利用Mega4．1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6），系統(tǒng)進(jìn)化分析表明植物的NHX1同源基因遺傳分化較為緊密，按照單子葉和雙子葉分別進(jìn)化。并且鹽生植物的NHX1基因聚在一個(gè)分支，禾本科的NHX1基因親緣關(guān)系較近。小擬南芥和擬南芥、琴葉鼠爾芥、鹽芥、油菜等植物的NHX1遺傳距離最近，屬于一類（classⅠ）液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。

圖6 植物Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig．6Phylogenetic tree of Na＋／H＋antiporter protein from different plants

2．4 p35S：：ApNHX1植物過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建

為了構(gòu)建過(guò)量表達(dá)載體，又設(shè)計(jì)了兩端分別帶有BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切位點(diǎn)的引物ApNHX1F5：5′－CGGGATCCATGTTGGATTCTCTA GTGTCGAAAC－3′和 ApNHX1R5：5′－GCTCTAG ATCAAGCCTTACTAAGATCAGGAGGG－3′。以測(cè)序正確的pMD18－T：：ApNHX1質(zhì)粒為模板，再次擴(kuò)增ApNHX1基因，克隆鑒定的方法同上。測(cè)序驗(yàn)證正確后，將該質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XbaⅠ酶切回收1613bp目的片段。同時(shí)將質(zhì)粒pCAMBIA2300－CaMV35S－OCS用BamHⅠ和XbaⅠ酶切，回收質(zhì)粒大片段。將1613bp的基因片段和質(zhì)粒大片段經(jīng)T4連接酶連接。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化方法同上。轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒用BamHⅠ和XbaⅠ進(jìn)行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物和pMD18－T：：ApNHX1質(zhì)粒酶切大小一致，均在接近2Kb處有一目的條帶，表明插入片段連接到目的載體上了（圖7A），這樣構(gòu)建了植物過(guò)量表達(dá)載體：p35S：：ApNHX1。最終載體p35S：：ApNHX1含有煙草花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子，章魚堿合成酶基因OCS作為終止子，及植物篩選標(biāo)記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NPTⅡ（圖7B）。

2．5 p35S：：ApNHX1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及驗(yàn)證

將質(zhì)粒p35S：：ApNHX1經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻的涂布在含有卡那（50mg／L）／利福平（25mg／L）抗性的 LB固體平板上涂勻，經(jīng)28℃溫育48h，挑取單克隆，利用引物ApNHX1F4和ApNHX1R4進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物與ApNHX1基因產(chǎn)物大小一致（圖7B）。結(jié)果表明植物過(guò)量表達(dá)載體p35S：：ApNHX1已經(jīng)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中了。

圖7 植物過(guò)量表達(dá)載體p35S：：ApNHX1的構(gòu)建Fig．7Construction of over－expression vector of p35S：：ApNHX1

3 結(jié)論與討論

在鹽脅迫下，植物細(xì)胞的離子均衡受到破壞，植物細(xì)胞為避免離子毒害，通過(guò)限制Na＋吸收、將Na＋外排或區(qū)隔化Na＋進(jìn)入液泡來(lái)維持離子均衡。目前，學(xué)者們一致認(rèn)為植物液泡Na＋區(qū)隔化主要依賴于植物液泡膜上Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，該蛋白的活性在維持細(xì)胞內(nèi)的離子均衡方面起到關(guān)鍵作 用［2－3，15］。 擬 南 芥 的 AtNHX1 蛋 白 是 跨 膜 蛋白，具有12個(gè)推測(cè)的跨膜區(qū)域，AtNHX1的N末端朝向細(xì)胞質(zhì)，但幾乎整個(gè)C端都位于液泡腔中。N端很保守，對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性非常重要，而C端變化很大，可能起調(diào)節(jié)作用［14－15］。

通過(guò)同源克隆的方法，從新疆小擬南芥中克隆得到了1個(gè)Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ApNHX1，比對(duì)分析和進(jìn)化樹構(gòu)建表明與擬南芥液泡膜上的AtNHX1相似性最高、親緣關(guān)系最近，同屬classⅠ類的液泡型的Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。而生物信息學(xué)分析的結(jié)果表明在氨基酸的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)等很多方面與At－NHX1還是有著明顯的不同。在ApNHX1蛋白的TM4跨膜區(qū)有2個(gè)關(guān)鍵的氨基酸，105位的半胱氨酸C和130位的甘氨酸A，在AtNHX1分別是精氨酸R和蘇氨酸T。本研究結(jié)果也表明小擬南芥和擬南芥的基因組有很高的相似性，但比擬南芥具有更高的耐鹽性，是不是2個(gè)氨基酸的突變影響蛋白的功能，還需進(jìn)一步研究。

為了進(jìn)一步研究該基因的功能，構(gòu)建了植物過(guò)量表達(dá)載體p35S：：ApNHX1，并且通過(guò)PCR檢測(cè)已將該載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101中，目前正在進(jìn)行擬南芥和小擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化研究。下一步研究將分析不同組織及不同脅迫情況的基因表達(dá)情況，以及研究亞細(xì)胞定位。我們的研究將進(jìn)一步解析植物NHX1基因家族如何行使功能的，豐富植物耐鹽信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)制。

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