動物專用喹諾酮類藥物對嗜水氣單胞菌體外抑菌作用的研究

蘇振霞, 肖 輝, 陳列歡, 張永立

(1. 淮海工學院 海洋學院, 江蘇 連云港 222005; 2. 江蘇省海洋資源開發(fā)研究院 甲殼素研發(fā)中心, 江蘇連云港 222005)

動物專用喹諾酮類藥物對嗜水氣單胞菌體外抑菌作用的研究

蘇振霞1,2, 肖 輝1,2, 陳列歡1,2, 張永立1

(1. 淮海工學院 海洋學院, 江蘇 連云港 222005; 2. 江蘇省海洋資源開發(fā)研究院 甲殼素研發(fā)中心, 江蘇連云港 222005)

采用瓊脂平板擴散法研究了乳酸恩諾殺星、鹽酸恩諾沙星、氧氟沙星、鹽酸沙拉沙星等11種抗生素對嗜水氣單胞菌的體外抑菌作用, 測定了抑菌圈大小; 采用雙倍試管稀釋法測得了最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。實驗結果表明, 鹽酸左氧氟沙星、氧氟沙星、鹽酸沙拉沙星對嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的抑菌效果最好, 其MIC分別為0.012, 0.024, 0.024 mg/L。乳酸恩諾沙星,鹽酸恩諾沙星, 氧氟沙星對嗜水氣單胞菌的殺菌活性最強, 其MBC為1.563 μg/mL。

氟喹諾酮; 嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila); 最小抑菌濃度; 最小殺菌濃度

嗜水單胞菌(Aeromonas hydrophila)廣泛分布于池水、淤泥等自然環(huán)境[1-2]。目前, 在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)由嗜水氣單胞菌感染的爆發(fā)性出血病較多, 如白鰱暴發(fā)性出血病、甲魚敗血病、黃鱔出血病、鰻鱺紅鰭病等。由嗜水氣單胞菌感染的疾病一般病勢較猛, 多為惡性傳染病, 死亡率很高。

目前我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗菌藥物的長期使用或濫用所引起的病原菌耐藥性問題嚴重, 對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。喹諾酮類藥物作為一種廣譜高效的抗菌藥物, 目前已廣泛應用于水生動物的疾病治療[3-4]。使用該類藥物治療水生動物的細菌性疾病時, 大多是借鑒獸醫(yī)對哺乳動物的研究成果, 因此造成該類藥物在水產(chǎn)業(yè)疾病防治用藥的盲目性[5]。

在治療魚病實踐中, 喹諾酮類藥物的用量呈逐年增長的趨勢。為了能正確選擇和安全使用該類藥物, 本實驗測定了11種動物專用喹諾酮類藥物對嗜水氣單胞菌的體外抑菌作用, 從中篩選出對嗜水氣單胞菌有較好體外抑制作用的喹諾酮類藥物, 旨在為該菌引起的爆發(fā)性魚病的防治提供科學的用藥依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 菌種

實驗用嗜水氣單胞菌由淮海工學院海洋學院生物技術實驗室提供。

1.2 藥品

鹽酸恩諾沙星(純度99 %, 浙江朗博藥業(yè)有限公司); 鹽酸諾氟沙星(純度 98%, 浙江省臺州市東港獸藥有限公司); 乳酸恩諾沙星(純度 98%, 浙江朗博藥業(yè)有限公司); 乳酸諾氟沙星(純度 98%, 浙江省臺州市東港獸藥有限公司); 鹽酸二氟沙星(純度 99%, 濰坊永興獸藥廠); 鹽酸左氧氟沙星(純度 90.5%, 浙江普洛康裕制藥有限公司); 鹽酸洛美沙星(純度 99%,浙江國邦藥業(yè)有限公司); 氧氟沙星(純度 98.5%, 浙江普洛康裕制藥有限公司); 鹽酸沙拉沙星(純度98%, 濰坊永興獸藥廠); 甲磺酸培氟沙星(純度77%,宜昌天仁藥業(yè)有限責任公司); 煙酸諾氟沙星(純度98%, 浙江省臺州市東港獸藥有限公司)。

2 實驗方法

2.1 藥液制備

將以上藥品分別配制成 200 mg/L的藥物原液,放于冰箱中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 菌懸液制備

液體培養(yǎng)基接種嗜水氣單胞菌后震蕩培養(yǎng) 12～16 h。菌液培養(yǎng)好后用液體培養(yǎng)基稀釋到合適濃度。本實驗中菌液濃度為1.0×108cfu/mL。

2.3 抑菌圈的測定

固體培養(yǎng)基平板直徑90 mm, 平板上加100 μL菌液, 涂抹均勻。用打孔器在每個平板上打 3個孔,做好藥物標記?？字屑尤胨幰?。放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察并用游標卡尺測量抑菌圈。

2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定

最小抑菌濃度(MIC)的測定采用戴自英雙倍試管稀釋法[6]。將每種藥物作為一組, 每組取 16支編號的無菌試管(其中兩支作為對照), 向前 14支試管中各加入液體培養(yǎng)基2 mL, 再用移液槍向1號試管中加200 mg/L的藥液2 mL, 并充分混勻; 更換槍頭,從1號管中取出2 mL放入2號管; 以此類推, 然后從14號管中吸出2 mL丟棄, 再向前14號管中各加菌液20 μL。最后向對照管1中加2 mL液體培養(yǎng)基,向對照管2中加2 mL液體培養(yǎng)基和20 μL的菌液。置入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 取出后觀察, 和對照管相比, 凡是藥物最高稀釋管中無細菌生長者, 該管的濃度即為該種藥物對該菌的最小抑菌濃度(Minimum Inhibition Concentration, 簡稱 MIC)。

2.5 最小殺菌濃度(MBC)的測定

在MIC實驗基礎上從無細菌生長的各管取材分別涂布于相應的無菌瓊脂平板培養(yǎng)基, 于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h, 觀察結果。瓊脂平板上無細菌生長且含藥液最少一管的藥液濃度, 即為該種藥物對該菌的最低殺菌濃度(Minimum Bacteriacidal Concentration, 簡稱 MBC)。

3 結果

3.1 抑菌圈結果分析

11種抗生素對嗜水氣單胞菌的抑菌效果見表1。

由表1可知, 這11種抗生素對嗜水氣單胞菌的抑菌效果由高到低的順序為鹽酸沙拉沙星、鹽酸左氧氟沙星、鹽酸二氟沙星、甲磺酸培氟沙星、氧氟沙星、鹽酸洛美沙星、鹽酸恩諾沙星、煙酸諾氟沙星、乳酸諾氟沙星、鹽酸諾氟沙星、乳酸恩諾沙星。

3.2 最小抑菌濃度MIC結果分析

最小抑菌濃度MIC結果分析見表2。

由表 2可知, 鹽酸左氧氟沙星對嗜水氣單胞菌的抑菌效果最好, 最小抑菌濃度為 0.012 μg/mL, 氧氟沙星、鹽酸沙拉沙星、鹽酸二氟沙星抑菌效果次之, 分別為0.024 , 0.024 , 0.049 mg/L。

表1 11種抗生素對嗜水氣單胞菌的體外抑菌圈直徑影響 Tab. 1 Inhibitory circles of eleven fluoroquinolones(FQs)against Aeromonas hydrophila

表2 11種抗生素對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度影響Tab. 2 MICs of eleven fluoroquinolones (FQs) against Aeromonas hydrophila

3.3 最小殺菌濃度MBC結果分析

由表3可知, 11種抗生素中對嗜水氣單胞菌的殺菌效果最好的為乳酸恩諾沙星, 鹽酸恩諾沙星, 氧氟沙星, 其MBC均為1.563 mg/L。而乳酸諾氟沙星、煙酸諾氟沙星和鹽酸諾氟沙星對嗜水氣單胞菌的殺菌效果最差, 煙酸諾氟沙星的MBC為50 mg/L, 乳酸諾氟沙星和鹽酸諾氟沙星的MBC大于100 mg/L。

4 討論

喹諾酮類藥物作為一種廣譜高效的抗菌藥物,應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖細菌病的防治始于20世紀70年代,隨著藥物價格的下降, 目前已被廣泛應用于水生動物的疾病治療[5]。目前, 應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖上的喹諾酮類藥物主要有諾氟沙星, 氧氟沙星, 恩諾沙星, 沙拉沙星等[7]。

表3 11種抗生素對嗜水氣單胞菌的最小殺菌濃度影響Tab. 3 MBCs of eleven fluoroquinolones (FQs) against Aeromonas hydrophila

本實驗選用的11種動物專用氟喹諾酮類藥物對嗜水氣單胞菌均有很強的抗菌作用, 其中以鹽酸左氧氟沙星、氧氟沙星、鹽酸沙拉沙星對嗜水氣單胞菌的抑菌活性最強, 乳酸恩諾沙星, 鹽酸恩諾沙星,氧氟沙星對嗜水氣單胞菌的殺菌活性最強。

關于喹諾酮類藥物對嗜水氣單胞菌的抑菌作用的研究報道不太多, 樊海平等[8]2005年報道, 鹽酸恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的MIC和MBC為0.0488 mg/L; 楊雨輝[4]2003年報道, 鹽酸恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的MIC和MBC分別為0.0125 mg/L和0.05 mg/L; 本實驗測定的鹽酸恩諾沙星和乳酸恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的MIC為0.098 mg/L, MBC為1.563 mg/L。盧彤巖[9]2004年報道, 菌液濃度影響藥物的MIC值, 且菌濃度變化引起MIC和MBC值大小的變化因藥物不同而異。在其實驗中, 嗜水氣單胞菌的接種量在102～105cfu/mL之間變化時, 恩諾沙星的MIC值不變, MBC值變化很小。當細菌接種量增至106cfu/mL, MIC值增加2倍, MBC值增加4倍。本實驗測得的鹽酸恩諾沙星和乳酸恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的 MBC較大的原因可能與菌液接種量有關,本實驗的嗜水氣單胞菌的接種量為106cfu/mL。當然細菌接種量對 MIC的影響并不是一定的。Aagaard等[10]進行了環(huán)丙沙星對臨床分離的 176株菌的體外抑菌活性試驗, 結果表明, 細菌接種量對 MIC無影響。影響藥物抗菌作用測定的因素很多, 培養(yǎng)基的選擇也會影響到藥敏試驗的結果[11]。

藥物敏感性測定作為篩選藥物的主要依據(jù), 仍將是氟喹諾酮類藥物研究的重點。但能影響藥物對細菌抑制作用的因素很多, 因此, 要科學、準確地測定藥物的抗菌作用, 必須最大程度的減少乃至排除各種主客觀因素的影響。為了使氟喹諾酮類藥物在水產(chǎn)動物疾病防治中得到合理應用, 作為藥物敏感性試驗的有效補充, 還有待進一步研究其在水產(chǎn)動物的藥代動力學及殘留, 這對于有效控制水產(chǎn)動物常見細菌性疾病的發(fā)生和流行將有重要意義。

[1]張海賓, 楊桂芳. 12種中草藥對嗜水氣單胞菌殺傷能力的研究[J]. 水產(chǎn)科學, 2006, 25(1)： 16-18.

[2]曹紅峰, 宋靖芳, 李國慶, 等. 中草藥對嗜水氣單胞菌 ST-3-3抑菌作用的研究[J]. 中醫(yī)藥導報, 2007,13(5)： 86-88.

[3]李軍, 黎志強, 樊品科. 氟喹諾酮類藥物對草魚常見病原菌的體外抑菌試驗[J]. 中國獸藥雜志, 1999,33(4)： 25-27.

[4]楊雨輝, 佟恒輝, 盧彤巖, 等. 幾種氟喹諾酮類藥物對嗜水氣單胞菌體外藥效學研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報, 2003, 34(4)： 368-371.

[5]王瑞旋, 陳畢生. 喹諾酮類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用研究概況[J]. 南方水產(chǎn), 2007, 3(3)： 73-79.

[6]戴自英, 劉裕昆, 汪復, 等. 臨床抗菌藥物學[M]. 北京： 人民衛(wèi)生出版社. 1985. 6-8.

[7]倪永武, 王正凱, 黃剛. 水產(chǎn)常用藥物簡介[J]. 內陸水產(chǎn), 2007, 10： 45-46.

[8]樊海平, 曾占壯, 林煜. 鹽酸恩諾沙星與其他四種抗菌藥物對水產(chǎn)致病菌的體外抗菌作用[J]. 福建水產(chǎn),2005, 1： 34-37.

[9]盧彤巖, 佟恒敏, 楊雨輝, 等. 幾種培養(yǎng)因子對喹諾酮類藥物抑制體外嗜水氣單胞菌活性的影響[J]. 大連水產(chǎn)學院學報, 2004, 19(3)： 189-193.

[10]Aagaard J, Gasser T, Rhodes P, et al. MICs of ciprofloxacin and trimethoprim for Escherich colo： influence of pH, inovulum size and vari-ous body fluids[J]. Infection, 1991, 19(Suppl 3)： 167-169.

[11]鄭天倫. 水產(chǎn)藥物抗菌作用測定研究進展[J]. 漁業(yè)現(xiàn)代化, 2007, 1： 58-43.

Bacteriostatic action of 11 fluoroquinolones to bacteriumAeromonas hydrophila

SU Zhen-xia1,2, XIAO Hui1,2, CHEN Lie-huan1,2, ZHANG Yong-li1
(1. Huaihai Institute of Technology, School of Marine Science, Lianyungang 222005, China; 2. Jiangsu Marine Resources Development Research Insititute, Chitins Research and Development Center, Lianyungang 222005,China)

Jul., 6, 2010

Fluoroquinolone(FQs);Aeromonas hydrophila; minimum inhibitory concentration; minimum bacteriacidal concentration

In this experiment, agar diffusion method was used to study antibacterial effect of 11 fluoroquinolones(FQs)onAeromonas hydrophila. The inhibition zone was measured, and the double tube dilution method was used to study minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC). The results showed that Levofloxacin hydrochloride, Ofloxacin, and Sarafloxacin hydrochloride had better antibacterial effect onA. hydrophila, and the MIC of the three medicines were 0.012, 0.024, 0.024mg/L, respectively. The Enrofloxacin lactate, Enrofloxacin hydrochloride, and Ofloxacin had the same MBC value of 1.563 mg/L.

S948

A

1000-3096(2011)07-0037-03

2010-07-06;

2010-09-20

淮海工學院自然科學基金項目(Z2009047); 江蘇省海洋資源開發(fā)研究院開放基金項目(JSIMR10C04)

蘇振霞(1978-), 女, 山東臨沂人, 副教授, 博士, 研究方向為水產(chǎn)藥物藥效學及藥物動力學, 電話： 0518-85588902, E-mail：suzhenxia@sina.com

康亦兼)