遲緩愛(ài)德華氏菌OppA蛋白的免疫原性及免疫保護(hù)分析

王妍妍, 李貴陽(yáng), 李 杰, 肖 鵬, 莫照蘭

(1．中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島266071; 2．中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100049)

遲緩愛(ài)德華氏菌OppA蛋白的免疫原性及免疫保護(hù)分析

王妍妍1,2, 李貴陽(yáng)1,2, 李 杰1,2, 肖 鵬1, 莫照蘭1

(1．中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島266071; 2．中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100049)

遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物重要的病原菌, 引起魚(yú)類(lèi)愛(ài)德華氏菌病, 免疫防治是針對(duì)該病的一個(gè)有效途徑。OppA是遲緩愛(ài)德華氏菌的一個(gè)寡肽透過(guò)酶組分, 作者開(kāi)展OppA的免疫原性及免疫保護(hù)性的研究, 旨在評(píng)價(jià)其作為魚(yú)類(lèi)愛(ài)德華氏菌病疫苗候選抗原的可行性。將致病性的遲緩愛(ài)德華氏菌LSE40的oppA克隆于表達(dá)載體pPROEXHTa, 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3), 表達(dá)重組蛋白6His-OppA, 并利用Ni-NTA SefinoseTMkit進(jìn)行純化。以純化的6His-OppA兩次注射免疫大菱鲆(Scophthalmus maximus), 第34天后檢測(cè)血清抗體效價(jià)為1： 1024; 以LSE40對(duì)免疫的大菱鲆進(jìn)行人工感染, 測(cè)得免疫保護(hù)率是25.9%。結(jié)果表明, OppA可刺激大菱鲆產(chǎn)生免疫應(yīng)答, 并具有免疫保護(hù)效果。

遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda); OppA; 原核表達(dá); 免疫應(yīng)答; 免疫保護(hù)

遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一種革蘭氏陰性細(xì)菌, 能引起水生動(dòng)物發(fā)病, 感染海水和淡水魚(yú)類(lèi)引起的疾病稱(chēng)為愛(ài)德華氏菌病(Edwardsiellosis), 給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。利用疫苗預(yù)防愛(ài)德華氏菌病的研究已取得一些進(jìn)展,滅活菌體、細(xì)胞碎片、表面脂多糖等菌體成分具有良好的免疫原性[5-7], 亞單位疫苗、減毒疫苗、DNA疫苗顯示了良好的免疫保護(hù)[8-14]。由于遲緩愛(ài)德華氏菌存在血清型差異, 導(dǎo)致一些疫苗的應(yīng)用效果不穩(wěn)定。篩選具有交叉保護(hù)作用的抗原是解決這個(gè)問(wèn)題的一條有效途徑。

細(xì)菌的寡肽透過(guò)酶(Oligopeptide permease, 簡(jiǎn)稱(chēng)Opp)由 OppABCDF 5個(gè)蛋白構(gòu)成, 主要負(fù)責(zé)依賴(lài)ATP水解的寡肽營(yíng)養(yǎng)攝取[15]。革蘭氏陰性菌的OppA作為底物結(jié)合蛋白, 能結(jié)合多種形式的寡肽, 為細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)[16], 還可作為細(xì)胞膜受體, 參與其他生理過(guò)程的調(diào)控, 如密度感應(yīng)[17], 孢子形成[18], 抗生素抗性[19], 菌膜形成[20], 細(xì)胞黏附[21], 胞內(nèi)寄生[22]等。一些研究顯示, 同種細(xì)菌的OppA高度保守, 作為抗原具有較好的免疫原性, 能夠不同程度地誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答, 提高宿主針對(duì)相應(yīng)病原的免疫保護(hù)力[23-26]。根據(jù) NCBI已公布的基因組序列信息,愛(ài)德華氏菌屬的 OppA氨基酸序列間相似度較高,分布在92%～99%。因此, OppA可能是一個(gè)抵抗愛(ài)德華氏菌病的良好的交叉保護(hù)性抗原。在前期工作中, 本實(shí)驗(yàn)室從遲緩愛(ài)德華氏菌LSE40 fosmid文庫(kù)克隆得到編碼寡肽透過(guò)酶的opp基因簇[27]。本研究通過(guò)體外表達(dá)遲緩愛(ài)德華氏菌OppA, 評(píng)價(jià)該蛋白在大菱鲆(Scophthalmus maximus)中的免疫原性和免疫保護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基

遲緩愛(ài)德華氏菌LSE40由本實(shí)驗(yàn)室從患病大菱鲆體內(nèi)分離保存[8]; 克隆載體 pEASY-T1(氨芐青霉素抗性)和大腸桿菌Trans-T1購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司, 表達(dá)載體 pPROEXHTa(氨芐青霉素抗性)來(lái)自 Invitrogen公司; 大腸桿菌 BL21(DE3)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司; 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(液體 TSB和固體 TSA)用于培養(yǎng)遲緩愛(ài)德華氏菌, LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)大腸桿菌; 氨芐青霉素(Amp)的使用質(zhì)量濃度為100 mg/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大菱鲆購(gòu)自山東青島膠南養(yǎng)殖場(chǎng), 體長(zhǎng)6～8 cm,體質(zhì)量15 g左右, 暫養(yǎng)于通氣的水族箱, 水溫16～18℃, 每隔兩天換水和投喂餌料。實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)選取3尾魚(yú), 取血清與遲緩愛(ài)德華氏菌 LSE40做血清凝集實(shí)驗(yàn); 同時(shí)取魚(yú)的內(nèi)臟器官勻漿涂布于 TSA平板進(jìn)行細(xì)菌分離。在確定未出現(xiàn)凝集反應(yīng)以及未分離到細(xì)菌的情況下, 該批魚(yú)方能進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 OppA表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)遲緩愛(ài)德華氏菌 LSE40的opp基因簇序列[27]設(shè)計(jì)上游引物 OppA-EcoRI-F(5′-TGAGAATTCGCCGAGGTTCCGGCCGGTGTA-3′,下 劃 線 為EcoRI內(nèi)切酶位點(diǎn))和下游引物 OppA-XhoI-R(5′-GCCTCGAGCACGACGCGCAATTAATGTTGAA CG-3′, 下劃線為XhoI內(nèi)切酶位點(diǎn)), 擴(kuò)增oppA基因的1583 bp片段, 該片段去除了編碼OppA N端信號(hào)肽的81 bp。所得PCR產(chǎn)物克隆到pEASY-T1載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1,在LB+Amp固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選, 挑取白色菌落經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng), 提質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI/XhoI雙酶切, 選擇插入片段大小符合的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。確認(rèn)克隆序列的正確后, 將插入片段連接到表達(dá)載體 pPROEXHTa, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3),經(jīng) LB+Amp培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性菌落, 進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切和 OppA-EcoRIF/OppA-XhoI-R為引物的PCR擴(kuò)增鑒定插入片段。含有正確重組質(zhì)粒的菌株命名為BL21/HtaOppA; 同時(shí)將空質(zhì)粒pPROEXHTa轉(zhuǎn)化到BL21(DE3), 獲得對(duì)照菌株BL21/Hta。

1.4 OppA重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

以37℃、1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)BL21/ Hta-OppA, 同時(shí)設(shè) BL21/HtaOppA 未誘導(dǎo)對(duì)照及BL21/Hta空質(zhì)粒對(duì)照, SDS-PAGE(12%分離膠和5%濃縮膠)檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。對(duì) BL21/HtaOppA進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化, 設(shè)置條件為： IPTG誘導(dǎo)濃度0.8、0.4、0.2 mmol/L, 誘導(dǎo)溫度 20、26、30、37℃,誘導(dǎo)時(shí)間3、4、5 h, 3要素形成36個(gè)組合。每組實(shí)驗(yàn)均以BL21/Hta為對(duì)照。誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)菌菌液經(jīng)超聲波破碎、離心, SDS-PAGE檢測(cè)上清和沉淀, 根據(jù)蛋白表達(dá)量的情況確定其中最優(yōu)的誘導(dǎo)條件組。按照優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)條件對(duì) BL21/HtaOppA大量培養(yǎng)(300 mL), 5 000g離心6 min收集菌體, 以Ni-NTA SefinoseTMkit(BIO BASIC INC.)純化目的蛋白。以SDS-PAGE檢測(cè)純化效果, 以 Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)測(cè)定純化蛋白濃度。

1.5 免疫實(shí)驗(yàn)

將大菱鲆隨機(jī)分成免疫組和對(duì)照組, 每組 30尾。純化的OppA重組蛋白6His-OppA與等體積完全弗氏佐劑(Sigma)混合, 以 30 μg 6His-OppA/尾魚(yú)的劑量, 對(duì)免疫組進(jìn)行腹腔注射免疫; 對(duì)照組則以等體積 PBS代替 6His-OppA, 其他條件與免疫組相同。第16天進(jìn)行二次免疫, 此時(shí)改用不完全弗氏佐劑, 其他處理方法與第一次相同。

二次免疫后第34天, 免疫組和對(duì)照組分別隨機(jī)挑取3尾魚(yú), 取血清, 對(duì)照組血清作為陰性對(duì)照, 以間接ELISA方法檢測(cè)免疫組血清抗體效價(jià)[28]。其余的魚(yú)以濃度為2.73×104cfu/尾的LSE40進(jìn)行腹腔注射攻毒。觀察并記錄死魚(yú)數(shù)量, 根據(jù)公式計(jì)算免疫保護(hù)率：

免疫保護(hù)率=(1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)×100%[29]。

2 結(jié)果

2.1 OppA表達(dá)載體構(gòu)建

圖1 重組表達(dá)菌株BL21/HtaOppA的構(gòu)建和鑒定Fig. 1 Construction and identification of recombinant strain BL21/HtaOppA

以篩選的BL21/HtaOppA作菌落模板, 以O(shè)ppAEcoRI-F/OppA-XhoI-R擴(kuò)增得到的片段大小為1.6 kb左右(圖1a)。該DNA片段去除了OppA蛋白N端27個(gè)氨基酸的信號(hào)肽編碼區(qū), 目的是提高 6His-OppA在大腸桿菌的表達(dá)量。同時(shí), BL21/HtaOppA中的質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切產(chǎn)生1.6 kb左右的DNA片段(圖 1b), 與預(yù)期的片段大小一致, 表明成功獲得OppA重組表達(dá)菌株BL21/HtaOppA。

2.2 OppA重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 經(jīng)1 mmol/L IPTG、37 ℃條件誘導(dǎo)的BL21/HtaOppA, 6His-OppA成功表達(dá)(圖2a), 但是主要以包涵體形式存在于細(xì)胞沉淀, 只有 30%左右的可溶蛋白存在于細(xì)胞上清。為提高可溶蛋白含量, 作者優(yōu)化了細(xì)菌的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和 IPTG誘導(dǎo)濃度, 優(yōu)化得到的條件為： 在26 ℃培養(yǎng)條件下,以 0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h, 此時(shí)約有80%的可溶性重組蛋白存在于細(xì)胞破碎物的上清(圖 2b), 經(jīng)純化, 獲得了高純度的目的蛋白(圖2c)。

2.3 血清抗體效價(jià)及免疫保護(hù)率

大菱鲆經(jīng)兩次免疫, 在加強(qiáng)免疫后的第 34天,檢測(cè)得到的免疫大菱鲆血清抗體效價(jià)是1：1 024。免疫組和對(duì)照組經(jīng)LSE40毒株攻毒, 如圖3所示, 對(duì)照組于攻毒后的第 8天開(kāi)始出現(xiàn)死亡, 免疫組于攻毒后的第11天開(kāi)始出現(xiàn)死亡; 在攻毒后第22天, 兩組累積死亡率均趨于穩(wěn)定, 此時(shí)免疫組累積死亡率為74.1%, 對(duì)照組為 100%, 且免疫組死亡時(shí)間明顯延后(P＜0.01), 計(jì)算得到的免疫保護(hù)率是25.9%。

圖2 SDS-PAGE檢測(cè)OppA重組蛋白的表達(dá)及純化Fig. 2 SDS-PAGE of 6His-OppA in bacteria lysates and in elution buffer

圖3 以遲緩愛(ài)德華氏菌LSE40攻毒后的大菱鲆累積死亡率Fig. 3 Accumulative mortalities of turbot after challenged with E. tarda LSE40

3 討論

本研究利用大腸桿菌表達(dá)菌株 BL21(DE3), 將遲緩愛(ài)德華氏菌 OppA蛋白編碼基因克隆到表達(dá)質(zhì)粒 pPROEXHTa的 6His標(biāo)簽之后, 獲得重組蛋白6His-OppA。由于誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白主要以包涵體形式存在, 蛋白純化過(guò)程中需經(jīng)變性和復(fù)性處理,將會(huì)增加操作難度, 所以我們進(jìn)行了表達(dá)條件的優(yōu)化。通過(guò)降低誘導(dǎo)時(shí)的培養(yǎng)溫度以及IPTG濃度, 有效減少包涵體生成, 使可溶性蛋白含量由 30%提高到80%。

本實(shí)驗(yàn)表明, 遲緩愛(ài)德華氏菌 OppA重組蛋白作為抗原, 能使大菱鲆產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答, 并起到一定的免疫保護(hù)作用, 這與鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的 OppA蛋白免疫小鼠的結(jié)果較一致[23,26]。根據(jù)結(jié)果, 本實(shí)驗(yàn)從免疫魚(yú)獲得的血清抗體效價(jià)(1： 1 024)低于鼠疫耶爾森菌和卡他莫拉菌的 OppA免疫小鼠獲得的血清抗體效價(jià)(1： 10 000～1： 32 000)。這種血清抗體效價(jià)的差異可能是因?yàn)榇罅怫遗c小鼠相比,免疫系統(tǒng)相對(duì)不完善, 免疫應(yīng)答能力比小鼠弱。另外,體外表達(dá)抗原的結(jié)構(gòu)變化、免疫劑量、免疫佐劑類(lèi)型以及免疫途徑等, 都可能導(dǎo)致免疫應(yīng)答水平和免疫保護(hù)效果的不同[26]。最近的一個(gè)研究顯示, 通過(guò)黏膜免疫途徑免疫卡他莫拉菌的 OppA蛋白, 提高了小鼠清除肺部致病性病原的能力[23]。

ABC輸送器家族蛋白被認(rèn)為是潛在的針對(duì)病原菌的疫苗候選抗原或藥物作用靶點(diǎn)[24]。Opp為ABC輸送器家族的一員, 其在抵抗病原侵染方面的功能日益受到人們的關(guān)注。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)得到的初步結(jié)果,OppA在大菱鲆顯示了一定的免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)。作者下一步將在免疫劑量、免疫佐劑類(lèi)型以及免疫途徑等方面開(kāi)展工作, 以期提高該蛋白的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)力, 達(dá)到控制愛(ài)德華氏菌病的目的。

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Immunogenicity and immunoprotection of oligopeptide permease A (OppA) ofEdwardsiella tarda

WANG Yan-yan1,2, LI Gui-yang1,2, LI Jie1,2, XIAO Peng1, MO Zhao-lan1
(1. Institution of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Graduate School,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Feb., 22, 2011

Edwardsiella tarda; OppA; Prokaryotic expression; Immune response; Immunoprotection

Edwardsiella tardais an important pathogen to aquaculture animals, causing fish edwardsiellosis diseases. Vaccination is an efficient protection against this disease in fish. OppA is a component of the oligopeptide permease system ofE. tarda. We evaluated the potential of OppA as an antigenic candidate vaccine against edwardsiellosis. TheoppAgene was cloned into expression vector pPROEXHTa and expressed inE. coliBL21 (DE3).The expressed 6His-OppA was purified with Ni-NTA SefinoseTMKit and used as an antigen to immunize turbot(Scophthamus maximus) twice. At day 34 post-vaccination, the serum antibody titer in the immunized fish was 1：1024, and the relative percentage survival (RPS) was 25.9% when the immunized turbot was challenged with pathogenicE. tarda. The present studies indicate that OppA ofE. tardacan induce immune response in fish and provide protection against edwardsiellosis.

Q939.91

A

1000-3096(2011)05-0019-05

2011-02-22;

2011-03-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31072245); 國(guó)家鲆鰈類(lèi)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(NYCYTX-50); 青島市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(08-1-7-2-HY)

王妍妍(1987-), 女, 山東濟(jì)寧人, 碩士, 主要從事海洋微生物與水產(chǎn)動(dòng)物病害防治研究, E-mail： wyy8701@163.com; 莫照蘭,通信作者, 電話： 0532-82898561, E-mail： zhlmo@qdio.ac.cn

譚雪靜)