不同劑量X線大分割照射對大鼠小腸的近期生物學效應

崔玉忠 安永恒 張桂芝

小腸是放射敏感的靶器官之一，腸道放射損傷與所采用的射線種類、照射劑量、照射方式及照射對象的不同有關。

Bcl-2家族基因是調控細胞凋亡最為重要的基因家族之一,Bcl-2基因是其中最具有代表性的抑制細胞凋亡的成員[1],Bax基因則是促進細胞凋亡成員的代表。盡管國內外對Bax和Bcl-2在腸組織中的表達情況已有報道,但對其結果卻存在較大的爭議[2]。

1 材料與方法

1.1 動物和分組

健康雄性Wistar大鼠 80只，體重為(240±20)g，由青島藥檢所提供，在自然光照，室溫16℃～20℃下，給予充足標準飼料及水，籠內喂養(yǎng)。

隨機分為空白對照組(0 Gy)；照射組采用32 Gy的等效生物劑量照射，4 Gy組，每天照射1次，共照射5次；6 Gy組，每隔1天照射1次，周一、三、五，共照射3次；8 Gy組，每周照射兩次，周一、三，共照射2次；12 Gy組照射1次，周一；每組有16只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 模型制作方法 大鼠用10 %水合氯醛(350 mg/ kg，腹腔注射) 麻醉后，固定于平板上，采用直線加速器(Varian 23EX型)，劑量率為300 cGy/min；使源皮距為100 cm；按照不同分組分別采用4 Gy、6 Gy、8 Gy、12 Gy的X射線進行上腹部照射(包括小腸區(qū))，軀體的其余部位用5 cm厚的鉛塊屏蔽。

1.2.2 檢測方法 照射組分別在照射結束后第1、3、5、7天各斷頭處死大鼠4只，空白對照組也同時于第1、3、5、7天各處死4只大鼠。在生理鹽水冰面上開腹取距回盲部10 cm以上的回腸組織約10 cm，用10%的福爾馬林液固定，常規(guī)脫水、透明、包埋,石蠟切片，分別進行HE染色及免疫組化染色，觀察病理變化。鼠抗人Bcl-2、Bax單克隆抗體、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗及DAB試劑均購自北京中杉生物技術公司。采用PBS液代替一抗作為陰性對照,采用已知的陽性片作為陽性對照。具體操作按照說明書進行。

1.3 結果判定方法

結果判定參照Rahman等的標準并適當修改。陽性細胞率≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。根據(jù)染色強度和陽性細胞數(shù)計分之和進行判斷：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～5分為陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。染色強度：無色0分；淡黃色1分；黃色2分；棕褐色3分。所有病理切片結果在作者與病理醫(yī)師幫助下分別閱片，若有疑義共同商議后確定。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用率或百分比表示，采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用χ2檢驗表示，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 放療后小腸的組織病理學變化

病理切片HE染色后,光鏡下觀察，與未照射組比較，所有照射組大鼠的小腸絨毛均出現(xiàn)不同程度縮短、數(shù)量減少,絨毛均有糜爛缺損，黏膜萎縮，潰瘍形成，基底部有溝裂形成，腸上皮細胞(絨毛上皮細胞和隱窩上皮細胞)可見不同程度受損壞死。分別于照射結束后第1、3、5、7天觀察，不同劑量組小腸絨毛長度、數(shù)量和壞死程度變化不大。不同劑量組間比較，以12 Gy、8 Gy組小腸絨毛損傷最為嚴重；4 Gy和6 Gy組次之。

2.2 Bcl-2和Bax蛋白在照射組和對照組中的表達

免疫組化染色后，光鏡下可見：空白對照組中Bax蛋白均呈陽性表達，表達率為100%(16/16)，陽性表達在小腸絨毛表面黏膜上皮，下段腺管上皮細胞未見明顯陽性表達，而在所有照射組中，Bax蛋白表達率均明顯下降，12 Gy、8 Gy照射組，于照射后第1、3、5、7天觀察，Bax蛋白均呈陰性表達，陽性率均為0(0/16)；與空白對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)，而4 Gy、6 Gy照射組，同樣于照射后第1、3、5、7天觀察，Bax蛋白陽性率為25%(4/16)；與空白對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)。而12 Gy、8 Gy照射組與4 Gy、6 Gy照射組組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.101)，見表1，表明未照射組小腸組織中Bax蛋白表達顯著強于照射組小腸組織，而照射組間其表達未見明顯差異。

表1 各組細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達情況(只)

在空白對照組中，Bcl-2蛋白不僅表達于小腸表面黏膜上皮細胞胞質中，下段腺管上皮細胞胞質也可見其陽性表達，這與Bax表達情況不完全相同，陽性表達率為100%(16/16)。而在所有照射組中Bcl-2蛋白表達均明顯下降，12 Gy、8 Gy照射組，于照射后第1、3、5、7天觀察，均呈陰性，陽性率均為0(0/16)；與空白對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)。4 Gy、6 Gy照射組，同樣于照射后第1、3、5、7天觀察，陽性率均為25%(4/16)；與空白對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)。而12 Gy、8 Gy照射組與4 Gy、6 Gy照射組組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.101)。表明未照射組小腸組織中Bcl-2蛋白表達顯著強于照射組小腸組織，而照射組間其表達未見明顯差異，見表1。

3 討論

電離輻射可引起生物體損害。消化道，尤其是小腸，對放射線高度敏感。放輻射損傷后，腸道黏膜屏障功能減弱甚至消失，腸道細菌及細胞分解產物進入血循環(huán)后引起的菌血癥和毒血癥是重要致死因素。

腸道上皮組織是1種更新快的組織，平均3～5天就要更新1次[3]，對放療化療包括分子靶向治療都非常敏感。電離輻射可以通過殺傷腸道黏膜上皮細胞和隱窩干細胞從而破壞腸道的吸收和屏障功能，致使絨毛上皮的更新缺乏來源，進而破壞其結構和功能的完整性，導致腸腺存活率降低[4]。

Bcl-2和Bax基因屬于Bcl-2基因家族的重要成員，Bcl-2是研究最早的與凋亡有關的基因，也是目前最受重視的調控細胞凋亡的基因家族，Bax是凋亡誘導基因,往往與Bcl-2以二聚體的形式存在于細胞內，Bcl-2/Bax比率是影響細胞凋亡的關鍵。Bcl-2可能在抑制細胞凋亡的同時，縮短細胞周期。從而促進腫瘤生長，這提示Bcl-2蛋白高表達與不良的臨床生物學行為有關。Bax基因具有促進細胞凋亡的功能，是Bcl-2的顯性抑制因子。細胞凋亡受到抑制會導致自身免疫性疾病或腫瘤等；而不恰當?shù)募せ顣l(fā)生組織器官的退行性病變或早衰[5]。

近年來許多學者指出，X刀立體定向治療與常規(guī)放療相比，可以提高靶區(qū)的精確性，提高腫瘤控制率，保護周圍正常組織，降低并發(fā)癥，其優(yōu)越性尤為明顯[6]。但如何最大限度的降低放療并發(fā)癥，保護正常組織，需要我們在以后的臨床和基礎工作中逐步完善。

通過我們的試驗結果可以看出，采用等效生物劑量為32 Gy的X線照射后，大鼠小腸均出現(xiàn)不同程度放射性損傷，在光鏡下觀察小腸損傷的程度，其中以12、8 Gy組損傷最為嚴重；4 Gy和6 Gy組次之；分析造成這個結果的原因：小腸為早反應組織，縮短總治療時間會加重對早反應組織的放射性損傷；12 Gy組僅在周一照射1次，8 Gy組在周一、三共照射2次；而4 Gy組和6 Gy組在周五照射結束；雖然大鼠在放療前進行了麻醉及固定等措施，但放療前的擺位、照射野的范圍、放療的次數(shù)等因素也會對照射結果產生一定影響。

從實驗的免疫組化結果分析：大鼠采用大分割放療后，小腸Bcl-2和Bax基因的表達均比未照射組降低。分析其中可能的原因：由于我們采用的照射劑量較大，小腸絨毛損傷較嚴重，因此，各照射組主要表達于小腸絨毛表面黏膜上皮的Bax基因陽性率出現(xiàn)明顯降低；Bcl-2基因不僅出現(xiàn)在小腸表面黏膜上皮細胞胞質中，且在下段腺管上皮細胞胞質也可見表達，因12、8 Gy照射組小腸絨毛損傷最嚴重，因此這兩組中Bcl-2和Bax基因的表達均為陰性；而4、6 Gy組中小腸的損傷相對較輕，因此，在這兩組中會有Bcl-2和Bax基因表達的陽性大鼠。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠采用大分割放療后，小腸Bcl-2和Bax基因的表達水平均下降，與未照射組比較有統(tǒng)計學意義，但是要進一步明確細胞凋亡及相關蛋白的表達與放射性損傷發(fā)生和發(fā)展的關系，還亟需更多的臨床和基礎研究來進一步完善。

[1]Sambaziotis D，Kapranos N，Kontogeorgos G.Correlation of b-cl-2 and bax with apoptosis in human pituitary adenomas〔J〕.Pituitary，2003,6(3)：127.

[2]彭 立,歐陽淼.大腸黏膜癌變過程中cox-2,bcl-2 及Bax 表達的相關性〔J〕.醫(yī)學臨床研究,2007,24(7):1140.

[3]Brittan M,Wright NA.Stem cell in gastrointestinal structure and neoplastic development〔J〕.Gut,2004,53(6):899.

[4]Fowler JF，Harari PM，Leborgne F，et al.Acute radiation reactions in oral and pharyngeal mucosa: tolerable levels in altered fractionation chedules〔J〕.Radiother Oncol，2003，69(2):161.

[5]Kam PC,Ferch NI.Apoptosis: mechanisms and clinical implications〔J〕.Anaesthesia,2000,55(11):1081.

[6]蔣國樑.束流調強的適形放療〔J〕.中國癌癥雜志,2008,18(6):466.