O-苯甲酰殼聚糖的合成及其抑真菌活性

馮永巍, 夏文水＊, 申麗麗, 趙云杰

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

O-苯甲酰殼聚糖的合成及其抑真菌活性

馮永巍1,2, 夏文水＊1,2, 申麗麗1,2, 趙云杰1,2

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

以甲烷磺酸為催化劑和氨基保護(hù)劑,苯甲酰氯與殼聚糖酯化合成了O-苯甲酰殼聚糖。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)經(jīng)FITR和1H-NMR光譜分析,酯化反應(yīng)發(fā)生在殼聚糖的羥基,游離氨基得到了很好保護(hù),平均取代度為0.35。以灰霉病菌Botry tis cinerea為受試菌種,研究了O-苯甲酰殼聚糖抑制真菌的活性,結(jié)果表明:殼聚糖和O-苯甲酰殼聚糖的有效中質(zhì)量濃度(EC50)分別為1.55 mg/m L和0.27 mg/m L,O-苯甲酰化殼聚糖的抑真菌活性顯著提高。

殼聚糖;O-苯甲酰化殼聚糖;抑真菌活性

殼聚糖是由氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的生物大分子聚合物,具有促進(jìn)傷口愈合、降低膽固醇、抑制微生物生長(zhǎng)等多種生理活性[1-3]。由于具有低毒、生物可降解、能抑制多種微生物生長(zhǎng)的特點(diǎn),殼聚糖被視為開發(fā)高效、無毒的新型食品防腐劑的理想基質(zhì)。然而,殼聚糖本身的防腐抗菌效果弱于目前廣泛使用的食品防腐劑,無法直接替代這些防腐劑在食品中的應(yīng)用[4],有必要通過化學(xué)改性的方法將其他的抑菌基團(tuán)引入殼聚糖分子中提高其抑菌活性。

殼聚糖分子中的氨基和羥基都是高活性的反應(yīng)位點(diǎn)。N-alkyl、N-benzyl、N,O-acyl殼聚糖衍生物都被證實(shí)了對(duì)細(xì)菌和包括灰霉病菌Botry tis cinerea在內(nèi)的真菌具有一定的抑制作用[5-7]。但有關(guān)選擇性的O-?；瘹ぞ厶茄苌锏难芯繄?bào)道并不多,這是因?yàn)?殼聚糖氨基的反應(yīng)活性高于羥基,制備過程中需要進(jìn)行氨基的保護(hù)和脫保護(hù),步驟復(fù)雜。然而,殼聚糖的游離氨基被認(rèn)為是殼聚糖發(fā)揮抑菌等生理活性的功能基團(tuán),氨基攜帶的正電荷與微生物細(xì)胞表面的負(fù)電荷相互作用,是引起細(xì)胞表面的劇烈改變和細(xì)胞的滲透性變化,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡主要原因[8]。因此,本研究利用甲烷磺酸在反應(yīng)中與氨基成鹽對(duì)氨基進(jìn)行保護(hù),在保留游離氨基的基礎(chǔ)上,將強(qiáng)抑菌基團(tuán)苯甲酸引入到殼聚糖分子,酯化合成具有雙抑菌基團(tuán)的O-苯甲酰殼聚糖衍生物。選擇引起植物病害的灰霉病菌B.cinerea為受試菌種,對(duì)O-苯甲酰殼聚糖的抑真菌作用進(jìn)行了研究,為殼聚糖類食品防腐劑的開發(fā)和分子設(shè)計(jì)進(jìn)行了有益的探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

殼聚糖,脫乙酰度(DD)=80%,相對(duì)分子質(zhì)量為3×105為南通雙林生物有限公司產(chǎn)品;馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、瓊脂,生化試劑;苯甲酰氯,甲烷磺酸,丙酮,氨水等均為分析純?yōu)閲?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;灰霉病菌Botrytis cinerea,由作者所在的江南大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供

1.2 儀器設(shè)備

SPX型智能生化培養(yǎng)箱:南京實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn);RW 20 DZM.n機(jī)械攪拌器:上海試驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn);SHB-Ⅲ循環(huán)水多用真空泵:鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn);5DDXB FT-IR紅外光譜儀、美國(guó)Nicolet公司生產(chǎn);B rucker ARX400核磁共振儀:德國(guó)Brucker公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 O-苯甲酰殼聚糖酯的合成 稱取干燥的殼聚糖1.7 g,加入25 m L甲烷磺酸,0～5℃不斷攪拌30 min。當(dāng)殼聚糖完全溶解后,逐滴滴加與氨基葡萄糖等摩爾比的苯甲酰氯,劇烈攪拌反應(yīng)3 h,于-18℃冷凍過夜。反應(yīng)液在丙酮中沉淀。沉淀在去離子中水溶解,用氨水溶液調(diào)節(jié)p H值到7.0,沉淀析出。丙酮索氏抽提沉淀24 h,真空干燥,得到淡黃色粉末苯甲酸殼聚糖酶的合成路線,見圖1。

1.3.2 產(chǎn)物表征

1)產(chǎn)物的紅外光譜 FITR KB r壓片法,在波數(shù)4 000～400 cm-1范圍記錄苯甲酰殼聚糖的 FITR圖譜。

2)核磁共振光譜1H NMR1H NMR在70℃溫度下進(jìn)行,以 TM S為內(nèi)標(biāo),樣品溶解于體積分?jǐn)?shù)2%的DCl D2O溶液。

1.3.3 抑真菌活性的測(cè)定

1)菌絲生長(zhǎng)測(cè)定法[8]將殼聚糖和O-苯甲酰殼聚糖分別溶解于體積分?jǐn)?shù)1%的冰醋酸溶液中,用1 mol/L NaOH調(diào)整溶液p H值至5.5～6.0。將上述溶液添加到直徑9 cm的滅菌PDA平板培養(yǎng)基中 ,制成濃度 0、0.75、1.50、3.0、6.0 mol/m L含藥培養(yǎng)基。在已經(jīng)培養(yǎng)7 d的B.cinereaPDA培養(yǎng)基的邊緣截取直徑6 mm供試菌餅移入到含藥培養(yǎng)基中心。暗處(26±2)℃培養(yǎng),每個(gè)處理重復(fù)4次。待對(duì)照組(0 mg/mL)菌落接近長(zhǎng)滿平板時(shí),用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,并計(jì)算抑菌率,公式如下:

圖1 苯甲酸殼聚糖酯的合成路線Fig.1 Synthetic route of O-benzoyl-chitosan

I=[(dc-dt)/dt-dp)]×100%

式中,I為抑制率;dc為對(duì)照菌落直徑;dt為處理菌落直徑;dp為菌餅直徑

2)抑制率回歸方程的建立 以濃度的對(duì)數(shù)值(X)和抑制率的對(duì)數(shù)值(Y)建立抑制率回歸方程。求出有效中濃度(EC50),其中EC50為抑制率達(dá)到50%抑菌劑的濃度。

3)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物的表征

2.1.1 產(chǎn)物的FTIR譜圖 殼聚糖與O-苯甲酸殼聚糖的紅外光譜見圖2。與殼聚糖相比,O-苯甲酰殼聚糖在波數(shù)1 730、1 260 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰,可歸屬為酯鍵中的C=O鍵和C—O鍵的伸縮振動(dòng)吸收。1 500～1 400 cm-1吸收峰,為取代基苯環(huán)的骨架的振動(dòng)吸收。并且在1 599 cm-1處仍保留了游離—NH2特征吸收峰。綜合以上結(jié)果,苯甲?；ㄟ^酯化反應(yīng)被引入到殼聚糖分子中,反應(yīng)主要在殼聚糖的羥基上進(jìn)行,C2位的-NH2在反應(yīng)中得到了很好的保護(hù)。

圖2 產(chǎn)物的紅外圖譜Fig.2 FITR spectrum of the synthesized compound

2.1.2 產(chǎn)物的1H-NMR1H-NMR數(shù)據(jù)δ=2.27×10-6(1.12H)為乙?；霞谆幕瘜W(xué)位移;δ=3.42×10-6(2.41H)為氨氫葡萄糖環(huán)上C2位CH的化學(xué)位移;δ=3.83～4.29×10-6(14.47H)為乙酰氨基葡萄糖環(huán)上C2-C6位CH的化學(xué)位移;δ=7.64～8.15×10-6(5.22H)為苯環(huán)上的CH的化學(xué)位移。

2.1.3 取代度的計(jì)算,公式如下

其中,DS為取代度;X為游離氨基比例;B為C2位CH的積分面積;C為乙酰氨基葡萄糖C2-C6位CH的積分面積;D為取代基上各個(gè) H積分面積;n為取代基上氫的個(gè)數(shù)。

經(jīng)過計(jì)算X=0.81,DS=0.35。游離氨基質(zhì)量濃度與母體殼聚糖基本一樣,說明酯化反應(yīng)主要發(fā)生在羥基,氨基沒有參與反應(yīng)。此前,也有報(bào)道選擇性合成了O-?；鶜ぞ厶茄苌颫,O-二癸酰殼聚糖和O-琥珀酰殼聚糖[9]。這些衍生物的合成需要鄰苯二甲酸酐對(duì)氨基進(jìn)行保護(hù),酯化后在水合肼中脫去氨基保護(hù),得到最終產(chǎn)物,步驟繁瑣,產(chǎn)率低。本研究采用的是一步反應(yīng)法制備O-?；瘹ぞ厶?。在反應(yīng)中,甲烷磺酸既是溶劑又是催化劑。當(dāng)在殼聚糖溶解在甲烷磺酸中時(shí),甲烷磺酸會(huì)與殼聚糖分子中的氨基形成鹽,并同C6位-OH和C3位-OH形成弱酯。此時(shí),殼聚糖分子中的氫鍵被破壞,分子間距離增大,分子鏈呈擴(kuò)張狀態(tài),因而在甲烷磺酸中形成均相體系,有利于O-?；磻?yīng)的發(fā)生,催化效率較高。當(dāng)體系中加入酰氯后,由于酰氯具有較強(qiáng)的親電性,進(jìn)攻弱酯,發(fā)生酯交換,從而形成新酯,由于殼聚糖的氨基與甲烷磺酸已成鹽,不與酰氯發(fā)生反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后向體系中加入氨水進(jìn)行中和,甲烷磺酸與氨水生成的鹽溶于水,因此可使平衡移動(dòng),使產(chǎn)物的氨基以自由形式存在,得到O-?；瘹ぞ厶钱a(chǎn)物。

2.2 O-苯甲酰殼聚糖的抑真菌活性

根根據(jù)1.3.3中的方法,得到不同濃度的殼聚糖及O-苯甲酰殼聚糖對(duì)B.Cinerer的抑制率,見表1。殼聚糖對(duì)B.cinerea具有一定的抑制作用,抑菌活性隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。但在低質(zhì)量濃度時(shí)(0.75～1.5 mg/m L)表現(xiàn)出很低的抑菌活性,抑制率不到50%,即使當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到6.0 mg/mL時(shí)也只能抑制B.cinerea菌絲的生長(zhǎng),而不能完全將其殺死,與Ahmed El Ghaouth的研究成果一致,說明殼聚糖抑真菌的作用有限,這可能與殼聚糖本身就是一些真菌細(xì)胞壁的成分有關(guān)[9]。通過化學(xué)改性將苯甲酸分子引入到殼聚糖分子中,顯著提高了殼聚糖在各濃度下的抑真菌活性,O-苯甲酰殼聚糖在較低濃度對(duì)B.cinerea菌絲的生長(zhǎng)就有比較強(qiáng)的抑制作用,質(zhì)量濃度達(dá)到6.0 m g/m L時(shí),幾乎可以完全抑制B.cinerea菌絲的生長(zhǎng)。Rabea EI合成了一系列N-苯甲酰殼聚糖的衍生物[10],與O-苯甲酰殼聚糖相比,這些衍生物對(duì)真菌的抑制作用并不顯著,可能是因?yàn)橛坞x氨基被屏蔽的結(jié)果。殼聚糖與O-苯甲酰殼聚糖對(duì)B.cinerea抑制作用回歸方程見表2,通過方程求出了對(duì)B.cinerea的EC50分別為1.55和0.27 mg/m L,說明殼聚糖同過苯甲?；男院?其抑真菌活性有了顯著提高。

表1 殼聚糖與O-苯甲酰殼聚糖對(duì)B.cinerea的抑制作用Tab.1 Inhibitive effect of chitosan and O-benzoyl-chitosan on radial growth of B.cinerea

表2 殼聚糖與O-苯甲酰殼聚糖對(duì)B.cinerea抑制作用回歸方程Tab.2 Regressive equation of chitosan and O-benzoyl-chitosan against B.cinerea

3 結(jié) 語

在甲烷磺酸作為催化劑和氨基保護(hù)劑的體系中,成功地合成了O-苯甲酰殼聚糖。?；磻?yīng)發(fā)生在殼聚糖的-OH,C2位的-NH2得到了很好保護(hù),產(chǎn)物平均取代度為0.35。殼聚糖和O-苯甲酰殼聚糖抑制B.cinerea生長(zhǎng)的 EC50分別為 1.55和 0.27 mg/mL,表明 O-苯甲酰殼聚糖對(duì)灰霉病菌B.cinerea的抑制作用較強(qiáng),高于其母體殼聚糖。

（References）：

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Syn thesis of O-benzoyl-Chitosan and Its An tifungi Activity

FENG Yong-wei1,2, XIA Wen-shui＊1,2, SHEN Li-li1,2, ZHAO Yun-jie1,2
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi214122,China;2.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

This study ssing MeSO3H as catalyst and protecting agent to synthesize O-benzoylchitsan by esterification between chitosan and benzoyl chloride.The structure of the product was analyzed by FITR and1H-NM R spectroscopy.The esterification mainly occurred on OH group rather than-NH2group of chitosan.The average degree of substitution(DS)was 0.35.The antifungi activity of O-benzoyl-chitsan against the greymould,Botrytis cinerea was carried out.The result showed that the EC50of chitosan and O-benzoyl-chitosan were 1.55 mg m L-1and 0.27 mg m L-1,respectively.The anti-fungi activity of O-benzoyl-chitosan was much stronger than that of chitosan.

chitosan,O-benzoyl-chitosan,antifungi activity

S 482.2

A

1673-1689(2011)03-0367-04

2010-05-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20876068);國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA 100401);江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)資金項(xiàng)目(BA 2009082)。

馮永巍(1980-),男,吉林長(zhǎng)春人,博士研究生,主要從事功能性食品劑的研究。

Email:fywzyy@yahoo.com.cn

＊

夏文水(1958-),男,江蘇南京人,工學(xué)博士,教授,博士研究生導(dǎo)師。主要從事功能食品研究。Email xiaw s@jiangnan.edu.cn