高效毛細(xì)管電泳法分離檢測(cè)人體血漿中鹽酸偽麻黃堿和磷酸可待因

李險(xiǎn)峰，朱平川

（1.惠州學(xué)院化學(xué)工程系，廣東 惠州516007；2.廣西大學(xué)廣西亞熱帶生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530005）

高效毛細(xì)管電泳法分離檢測(cè)人體血漿中鹽酸偽麻黃堿和磷酸可待因

李險(xiǎn)峰1，朱平川2

（1.惠州學(xué)院化學(xué)工程系，廣東 惠州516007；2.廣西大學(xué)廣西亞熱帶生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530005）

建立毛細(xì)管區(qū)帶電泳同時(shí)測(cè)定人體血漿中鹽酸偽麻黃堿和磷酸可待因含量的方法.在75μm I.D×60cm未涂層石英毛細(xì)管中，以30mmol／L Tris－HCl為電泳緩沖溶液，分離電壓為22kV時(shí)，兩種被測(cè)組分在5 min內(nèi)達(dá)到基線分離.鹽酸偽麻黃堿和磷酸可待因的檢出限分別為0.50、0.30μg／mL，樣品加標(biāo)回收率在88%～95%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%.該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，并成功用于人體血漿樣品的分析.

毛細(xì)管電泳；鹽酸偽麻黃堿；磷酸可待因；人體血漿

鹽酸偽麻黃堿是中草藥麻黃中提取的胺類生物堿，具有松弛平滑肌，興奮中樞神經(jīng)，發(fā)汗解熱等作用［1］，中樞神經(jīng)興奮作用遠(yuǎn)較腎上腺素強(qiáng).磷酸可待因也是藥物中常見(jiàn)的生物堿，研究表明，具有多種生理活性和藥理療效［2］，如鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳及抑制呼吸等.但是這兩種生物堿都具有一定的毒性和麻醉性.

近年來(lái)，吸毒和藥物濫用對(duì)人們的生活和社會(huì)安定構(gòu)成了極大威脅，因此發(fā)展準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)血漿等體液中毒品及麻醉類物質(zhì)的分析方法具有重要意義.上述兩種常見(jiàn)生物堿檢測(cè)方法已有報(bào)道，如高效液相色譜法［3］及毛細(xì)管電泳法［4］，毛細(xì)管電泳－電致化學(xué)發(fā)光法［5］以及液相色譜－質(zhì)譜法［1］等.其中毛細(xì)管電泳（CE）由于具有分離效率高、速度快及樣品消耗少等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于尿樣、血清及單細(xì)胞等生物樣品的分離分析［6－8］.文中提出了一種毛細(xì)管電泳同時(shí)分離檢測(cè)鹽酸偽麻黃堿、磷酸可待因的新方法，對(duì)電泳分離條件的影響進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，并將該方法成功應(yīng)用于人血漿樣中此兩種物質(zhì)含量的分析.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑美國(guó)Beckman公司P／ACETM MDQ毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，二極管陣列檢測(cè)器；工作站：32Karat TM，未涂層彈性石英毛細(xì)管（75μm I.D×60cm，有效長(zhǎng)度50cm）（河北永年銳灃色譜器件有限公司）；Thermo Orion 720A型酸度計(jì)／離子計(jì)（美國(guó)）；MILLIPORE超純水系統(tǒng)（美國(guó)）；Sartorius ME 215S電子天平（德國(guó)）；Eppendorf Centrifuge 5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；KQ2200DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；三（羥甲基）氨基甲烷（生化試劑BR；國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純，所用水為超純水；對(duì)照品鹽酸偽麻黃堿、磷酸可待因購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所.

1.2 溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取鹽酸麻黃堿、磷酸可待因?qū)φ掌犯?0.0mg，置于10mL量瓶中，用水溶解并定容，配成1.00mg／mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，密封于4℃下冰箱中保存.

1.3 血漿的預(yù)處理抽取健康青年志愿者血液3mL，加肝素抗凝，于3 500r／min離心10min，上層清液即為血漿.取空白血漿和加標(biāo)血漿200μL于試管中，加入0.1mol／L NaOH 50μL，乙酸乙酯2mL，渦旋振蕩5min，于12 000r／min離心10min，取出乙酸乙酯層于試管中.此過(guò)程重復(fù)3次，所得乙酸乙酯溶液合并在一起，于80℃水浴中氮?dú)獯蹈?，然后?00μL甲醇沖洗試管壁收集樣品后蒸干，殘余物用200μL水溶解.

1.4 電泳分離條件以30mmol／LTris－HCl（pH＝8.0）為電泳介質(zhì)，未涂層彈性石英毛細(xì)管（75μmI.D×60cm）為分離通道，壓力進(jìn)樣（0.5psi×6sec），分離電壓為22kV，分離溫度為25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm.實(shí)驗(yàn)前緩沖溶液用0.45μm濾膜過(guò)濾，并用超聲波脫氣5min.毛細(xì)管在使用前，用0.1mol／L氫氧化鈉沖洗10min，然后用水和緩沖溶液各沖洗5min.每?jī)纱芜\(yùn)行之間用緩沖溶液沖洗3min.更換緩沖溶液時(shí)先用超純水和新的緩沖溶液各沖洗5min.

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳條件的優(yōu)化

2.1.1 緩沖體系的選擇 分別考察了 Tris－H3BO3、Tris－H3PO4、Tris－HCl、Tris－檸檬酸（Cit）緩沖體系（pH＝8.0）對(duì)分離的影響.結(jié)果表明：在Tris－H3BO3，Tris－檸檬酸（Cit）體系中鹽酸偽麻黃堿靈敏度低，磷酸可待因峰形很寬；Tris－H3PO4體系中磷酸可待因峰靈敏度低，而在Tris－HCl體系中鹽酸偽麻黃堿、磷酸可待因能夠得到比較好的分離.因此選擇Tris－HCl體系為運(yùn)行緩沖溶液.

2.1.2 緩沖溶液中Tris濃度對(duì)分離的影響 實(shí)驗(yàn)考察了Tris濃度在20～60mmol／L范圍內(nèi)對(duì)分離的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著Tris濃度的增大，各組分的分離度無(wú)明顯改善，只影響各組分的出峰時(shí)間.當(dāng)Tris濃度高于60mmol／L時(shí)，各峰的遷移時(shí)間延長(zhǎng)，焦耳熱效應(yīng)增加，造成基線噪音增加；當(dāng)Tris濃度為30mmol／L時(shí)，各物質(zhì)間分離度最好，遷移時(shí)間也較短.因此選定Tris濃度為30mmol／L.

2.1.3 緩沖溶液pH值對(duì)分離的影響 緩沖液的pH不僅會(huì)影響電滲流的大小，而且還影響到被測(cè)物的有效電荷數(shù)，因此通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖液的pH值可以改變分析物的遷移行為和分離效率.實(shí)驗(yàn)考察了pH從6到9范圍內(nèi)pH變化對(duì)各峰的影響，當(dāng)pH小于6時(shí)它們之間的分離度有所增加，但遷移時(shí)間不斷延長(zhǎng)；pH超過(guò)9之后，磷酸可待因的峰形變差.綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇pH＝8.0.

2.1.4 電壓對(duì)分離的影響 實(shí)驗(yàn)考察了15～30kV范圍內(nèi)分離電壓對(duì)遷移時(shí)間和峰形的影響，結(jié)果表明：隨著分離電壓的升高，樣品的分析時(shí)間縮短，峰形尖銳.當(dāng)分離電壓達(dá)到30kV時(shí)，前兩峰的分離度變小，且基線也變得不太平穩(wěn)，重復(fù)性差.在保持分離度及維持良好峰形的前提下，以22kV時(shí)分離效果最佳，鹽酸麻黃堿和磷酸可待因組分在5min內(nèi)可獲得很好的基線分離.

2.1.5 進(jìn)樣時(shí)間對(duì)分離的影響 固定0.5Pa的壓力進(jìn)樣，在5～10s范圍內(nèi)改變進(jìn)樣時(shí)間.實(shí)驗(yàn)表明進(jìn)樣時(shí)間越長(zhǎng)，靈敏度越高.但隨著進(jìn)樣量的增大，溶質(zhì)區(qū)帶加寬，分離度下降，峰形變差.綜合考慮各因素，選擇進(jìn)樣時(shí)間為6s.

圖1 空白血漿（a）和濃度為10mg／L的鹽酸偽麻黃堿（峰1）和磷酸可待因（峰2）（b）的加標(biāo)血漿CE圖

2.2 線性關(guān)系與檢出限在最優(yōu)條件下，由對(duì)照品貯備液精確配制成不同質(zhì)量濃度的系列混合溶液于優(yōu)化后的條件下進(jìn)行電泳分析.分別重復(fù)進(jìn)樣5次，工作曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限（S／N＝3）分別為：鹽酸偽麻黃堿，y＝317x＋469.82，2～300 mg／L，R＝0.999 1，0.5mg／L；磷酸可待因，y＝833.33x＋1 612.6，1～300mg／L，R＝0.998，0.3mg／L.

表1 鹽酸偽麻黃堿和磷酸可待因在人血漿中的回收率（n＝5）

2.3 樣品測(cè)定為了消除血樣中無(wú)機(jī)鹽和蛋白質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾，空白人血漿和加標(biāo)人血漿均以1.3方法進(jìn)行處理，在最佳檢測(cè)條件下，利用毛細(xì)管電泳法對(duì)血漿中的鹽酸偽麻黃堿和磷酸可待因進(jìn)行測(cè)定，在空白血漿中沒(méi)有檢測(cè)出此兩種物質(zhì)，將分別含有10mg／L鹽酸偽麻黃堿和磷酸可待因的加標(biāo)血漿樣品連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得鹽酸偽麻黃堿和磷酸可待因的RSD分別為4.6%和4.8%，結(jié)果如圖1所示.從圖中可以看出，血漿中的雜質(zhì)不干擾兩種物質(zhì)的測(cè)定.這兩種物質(zhì)的回收率結(jié)果見(jiàn)表1.

3 結(jié)論

文中提出運(yùn)用毛細(xì)管電泳對(duì)鹽酸偽麻黃堿和磷酸可待因進(jìn)行分離檢測(cè)，并將此法應(yīng)用于人血漿中測(cè)定，血漿中雜質(zhì)不干擾兩種被測(cè)物質(zhì)的分離檢測(cè).該方法靈敏、簡(jiǎn)單、快速、可靠，并有望用于該藥物的藥代動(dòng)力學(xué)等方面的研究.

［1］郭俊峰，楊冀州，李淑娟.液相色譜－質(zhì)譜／質(zhì)譜法快速測(cè)定保健品中違禁成分麻黃堿、偽麻黃堿和鹽酸芬氟拉明［J］.中國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫雜志，2008，31（6）：415－417.

［2］高利娜，劉俊亭，王永明，等.止咳糖漿中磷酸可待因含量的測(cè)定［J］.藥物分析雜志，2007，27（11）：1738－1741.

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［4］羅金文，朱海霖，李會(huì)林.流動(dòng)注射－毛細(xì)管電泳分流式電動(dòng)進(jìn)樣歧視效應(yīng)特征的研究［J］.色譜，2005，23（2）：189－192.

［5］劉彥明，田偉.毛細(xì)管電泳電致化學(xué)發(fā)光靈敏檢測(cè)毒品類生物堿及在尿樣分析中的應(yīng)用［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2009，30（1）：51－53.

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［7］Deng B Y，Shi A H，Li L Q，et al.Pharmacokinetics of amoxicillin in human urine using online coupled capillary electrophoresis with electrogenerated chemiluminescence detection［J］.J Pharmaceut Biomed Anal，2008，48：1249－1253.

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Simultaneous determination of pseudoephedrine hydrochloride and codeine phosphate in human plasma by capillary electrophoresis

LI Xianfeng1，ZHU Pingchuan2
（1.Department of Chemical Engineering，Huizhou University，Huizhou 516007，China；2.Guangxi Key Laboratory of Subtropical Bio－resources Conservation and Utilization，Guangxi University，Nanning 530005，China）

A capillary zone electrophoresis method was established for the simultaneous determination of pseudoephedrine hydrochloride and codeine phosphate in human plasma.Optimized separation was achieved on an uncoated fused silica capillary（75μm I.D×60cm）using 30mmol／L Tris－HCl as the running buffer（pH＝8.0）.Under the optimized operated conditions，applied voltage of 22kV and detection wavelength of 214nm，baseline separation of each component in 5minutes had been obtained.The detection limits for pseudoephedrine hydrochloride and codeine phosphate were 0.50，0.30μg／mL，respectively.The average recoveries were between 88%－95%and the relative standard deviations were less than 5%，the method was successfully applied to the determination in human plasma sample.

capillary electrophoresis；pseudoephedrine hydrochloride；codeine phosphate；human plasma

O657.8

A

1000－2375（2011）04－0525－03

2011－04－08

惠州學(xué)院科研項(xiàng)目（C210·0222）資助

李險(xiǎn)峰（1980－），男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，E－mail：wind9425＠163.com

（責(zé)任編輯 胡小洋）