稻殼中黃酮類化合物的微波提取及其抗氧化活性研究

(佳木斯大學藥學院,黑龍江佳木斯154007)

稻殼中黃酮類化合物的微波提取及其抗氧化活性研究

張羽男,蘇宏宏,江 惠,李亞菲,黃 強,劉 楝,孫 旭,周 維,胡月茹,李澤涵

(佳木斯大學藥學院,黑龍江佳木斯154007)

目的:研究稻殼中總黃酮的最佳提取工藝及其抗氧化作用。方法:提取工藝采用微波法,以總黃酮提取率為考察指標,選用L9(34)表進行正交試驗;抗氧化試驗采用Fenton反應(yīng)法和烘箱儲藏法,通過比較吸光度和POV值研究其抗氧化活性。結(jié)果:最佳的提取條件為乙醇濃度70%,提取時間120s,固液比1g¨10mL,微波功率700 W,提取率可達0.313%;抗氧化試驗結(jié)果表明,稻殼中提取的總黃酮具有較強的清除羥基自由基能力和阻斷豬油自氧化作用的能力。結(jié)論:稻殼中提取的黃酮類化合物具有良好的抗氧化活性。

稻殼;黃酮類化合物;微波提取法;抗氧化性

稻殼又名碧糠或大糠,按質(zhì)量計約占稻谷的20%,是碾米廠的主要副產(chǎn)品之一。每年我國稻殼年產(chǎn)量可達8000多萬噸,但由于稻殼本身密度小,難于運輸和貯存;外殼堅硬,不易被土壤消化;營養(yǎng)價值低,不適合作飼料;所含纖維短,不適合造紙,常被視為廢棄物而燃燒掉,沒有被很好地開發(fā)和利用[1]。然而,研究表明,稻殼中含有許多如黃酮、低聚木糖及綠原酸等具有較高藥用價值的活性成分[2]。其中,黃酮類化合物具有抗氧化、抗突變、抗衰老、抗腫瘤、降血脂及治療心腦血管疾病等多方面的生理功效[3,4]。因此,如何綜合有效地利用廢棄稻殼生產(chǎn)具有醫(yī)用保健功能的黃酮類化合物,就極具學術(shù)意義和經(jīng)濟價值。本研究以稻殼為原料詳細研究了微波提取分離黃酮類化合物的方法與條件,建立了最佳提取與純化工藝,并對其抗氧化活性進行了研究,為利用廢棄稻殼工業(yè)化生產(chǎn)黃酮類藥用保健成分提供科學依據(jù)。

1 材料、試劑、儀器

1.1 主要材料

原料:水稻谷殼,簡稱稻殼,來源于黑龍江省樺南縣。

試劑:蘆丁標準品,上海生化制劑廠。三氯甲烷、KI、H2O2、冰乙酸、FeSO4、NaOH、水楊酸等均分析純。

1.2 主要儀器

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);FA 2004電子天平(上海恒平科學儀器有限公司);格蘭仕G70D20N 1L-M1(SO)微波爐(格蘭仕公司);Spectrum lab-54型紫外-可見分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)等。

2 實驗方法

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

精密稱取蘆丁對照品25.0mg,80%乙醇溶解后,移至100mL容量瓶,定容。精密吸取2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0mL分置于50mL容量瓶中,分別加入5%NaNO2溶液1.5mL,混勻,放置6min,加入10%的Al2(SO4)3溶液1.5mL,混勻,放置6min,加4%NaOH溶液20mL,加水至刻度,搖勻,放置15min。在510nm 的波長處測定其紫外吸光度。以吸光度值(A)為縱坐標,蘆丁溶液的濃度(C)為橫坐標,繪制標準曲線。

2.2 原材料的預(yù)處理

本試驗所用稻殼來源于黑龍江省樺南縣農(nóng)戶,采用乙醇作為溶劑。當乙醇作溶劑時,不可避免的將脂溶性色素一起提取出來,這將對結(jié)果分析帶來不必要的干擾,故原料預(yù)先進行石油醚脫脂、脫色素,以排除干擾。具體方法為:將稻殼清洗干凈,置于60℃恒溫干燥箱內(nèi)進行烘干(24h),取出后粉碎過篩,然后將稻殼用索氏提取法(石油醚為抽提劑,80℃水浴浸泡)除去米糠油等脂溶性物質(zhì),當虹吸管中石油醚提取液無色時,減壓過濾,取濾渣并將殘留在其中的石油醚揮盡。再用不同濃度的乙醇溶液作為溶劑提前浸泡稻殼24h,備用。

2.3 提取條件的正交設(shè)計

為全面考察微波提取法的工藝參數(shù)及最佳操作條件,按照正交表L9(34)安排四因素三水平的正交試驗,如表1所示。

表1 試驗因素水平表

2.4 稻殼中提取黃酮的工藝流程

原料的預(yù)處理→稱取40g干燥粉末→浸提劑浸泡24h→微波法提取→冷卻→抽濾→濃縮→棕色容量瓶定容→避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 提取物的精制

采用萃取法對提取物進行精制。將提取液放在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓濃縮至1/3后將濾液在80℃水浴上蒸干,所得固體加入水10mL溶解,再加入三氯甲烷10mL,振搖,轉(zhuǎn)入分液漏斗,靜置分層,棄去三氯甲烷層,水溶液再加入三氯甲烷10mL(重復(fù)1次),將水層減壓蒸餾,濃縮,水浴蒸至近干,干燥得精制品,備用。

2.6 提取物的定性檢驗

采用顯色法進行黃酮的定性檢驗。稱取一定量的精制品,溶于80%乙醇配成濃度為5%的溶液。利用鹽酸-鎂粉,4%NaOH溶液及1%FeCl3溶液的顯色反應(yīng),觀察其顏色變化。

2.7 Fenton反應(yīng)法[5]測定稻殼中總黃酮的抗氧化能力

取5支帶塞的試管,依次編號。每支試管分別加入9mmol/L的FeSO4溶液1mL,9mmol/L的水楊酸-乙醇溶液2mL,按試管編號各加入不同濃度的黃酮水溶液2mL,最后加入8.8mmol/L的H2O2溶液2mL進行反應(yīng),放于在37℃下水浴條件下反應(yīng)1h,以蒸餾水代替黃酮水溶液作空白對照,在510nm處測定樣品的吸光度,記錄數(shù)據(jù)。其清除自由基的清除率可用公式表示如下:

式中:AS為加入提取液后的吸光度;A 0為空白對照液的吸光度;A為溶液本身的吸光度。

2.8 稻殼中黃酮類化合物在豬油中的抗氧化作用

采用烘箱儲藏法測定提取物對豬油自氧化的抗氧化能力。豬油由市售板油在燒杯中用文火熬煉而成。稱取粗黃酮粉0.05、0.10、0.20g,各用5mL濃度為60%乙醇溶解后分別加到20.00g溫熱豬油中,攪勻,以不加稻殼黃酮粉,僅在20.00g豬油中加入60%乙醇5mL為對照樣,在(65±1)℃烘箱中強化保存,每隔2d取樣測定豬油中的過氧化值(POV值),并以此來表示豬油的氧化速度,進而衡量稻殼中黃酮類化合物的抗氧化活性。樣品的過氧化值(POV)計算:

式中:POV為樣品的過氧化值,mmol/kg;V 1為試樣消耗硫代硫酸鈉標準溶液體積,mL;V 2為空白試驗消耗硫代硫酸鈉標準溶液體積,mL;N為硫代硫酸鈉標準溶液的摩爾濃度,mol/L;0.1269為1mg硫代硫酸鈉相當?shù)獾目藬?shù);W 為試樣的質(zhì)量,g。

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標準曲線的繪制

標準曲線如圖1所示。進行線性回歸,得回歸方程:y=5.5045x+ 0.0053(r= 0.9974)

圖1 蘆丁標準曲線

3.2 正交試驗結(jié)果與分析

微波法提取稻殼中的黃酮類化合物的正交試驗結(jié)果如表2所示,各種因素對黃酮提取量影響的主次順序為:微波時間＞乙醇濃度＞微波功率＞固液比,最佳的提取條件為乙醇濃度70%,提取時間120s,固液比1g¨10mL,微波功率為高火(700 W),即A 3B2C2D3。經(jīng)驗證實驗得出該條件下黃酮類化合物的提取率為0.313%。

表2 微波法提取黃酮類化合物正交實驗結(jié)果

3.3 提取物的定性檢驗結(jié)果

稻殼提取物與鹽酸-鎂粉反應(yīng)產(chǎn)生橙色泡沫;與NaOH反應(yīng),溶液變黃色;與FeCl3反應(yīng),生成墨綠色溶液。表明稻殼提取物中可能含有黃酮類、黃酮醇類、雙氫黃酮類等多種黃酮類化合物。

3.4 抗氧化活性研究

3.4.1 稻殼中黃酮化合物清除羥基自由基的活性

黃酮類化合物可作為金屬離子螯合劑,阻斷Fenton反應(yīng)系統(tǒng)中自由基的生成。按照實驗方法測定吸光度,并計算清除率,結(jié)果見表3。

表3 稻殼中黃酮類化合物對羥基自由基的清除率

由表3可以看出,稻殼中總黃酮提取液對由Fenton體系產(chǎn)生的·OH有一定的清除作用,隨著總黃酮提取液濃度的增加,對自由基(·OH)的清除能力也增強.當提取液濃度達到1.5%時,提取液對羥自由基的清除作用達到最大。

3.4.2 POV值測定法

不同濃度的樣品POV值隨時間變化情況如表3?？梢钥闯?相對于對照樣,在豬油中添加不同質(zhì)量的黃酮粉,均可顯著抑制豬油的自動氧化,表現(xiàn)比較強的抗氧化性。而且隨著添加量的增加,抗氧化能力也隨之增強?？傮w來看,添加量越大抗氧化效果越好。

表4 稻殼中黃酮類化合物對豬油的抗氧化作用

4 討論

本實驗通過設(shè)計正交試驗確定了微波法提取稻殼中黃酮類化合物的最佳提取條件:乙醇濃度70%,提取時間120s,固液比1g¨10mL,微波功率700 W。抗氧化性的研究表明稻殼中黃酮類化合物具有較強的清除自由基能力和顯著的抗豬油過氧化作用,且在一定濃度范圍內(nèi),稻殼黃酮類化合物濃度越大,其抗氧化性越強。

[1]吳彬,馬正智,周偉,等.從稻殼中提取制備低聚木糖研究進展[J].中國食品添加劑,2009,94-100

[3]孔琪,吳春.菊花黃酮的提取及抗氧化活性研究[J].中草藥,2004,35(9):1001-1002

[4]陳乃富,張莉.蕨菜黃酮類化合物的提取與分析[J].中國林副特產(chǎn),2004,(6):1-4

[5]李貴榮.枸杞多糖的提取及其對活性氧自由基的清除作用[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學雜志,2002,19(2):94-96

R284

A

1008-0104(2011)06-0083-02

2011-09-20)

佳木斯大學大學生科技創(chuàng)新項目,編號:Dz2011-057。

張羽男(1979～)男,黑龍江佳木斯人,博士,講師,研究方向為天然藥物化學。