紫外線對枯草芽孢桿菌的誘變效應研究

孫愛杰，孫本風，趙純潔

（黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，a檢測中心；b.研發(fā)中心（北京）；黑龍江 齊齊哈爾 161006）

紫外線對枯草芽孢桿菌的誘變效應研究

孫愛杰a，孫本風b，趙純潔a

（黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，a檢測中心；b.研發(fā)中心（北京）；黑龍江 齊齊哈爾 161006）

枯草芽孢桿菌是一種無毒副作用、無殘留的綠色飼料添加劑，研究表明，可以利用枯草芽孢桿菌進行生物防治或生產微生物殺菌劑以替代劇毒化學藥品。利用紫外線對枯草芽孢桿菌進行誘變，通過實驗紫外線處理150 s時致死率幾乎為100%，120 s時誘變效果最好，對大腸桿菌的抑菌效果最明顯。

枯草芽孢桿菌；紫外線；誘變

Kew words：Bacillus subtilis；ultraviolet radiation；mutagenic effects

0 引 言

近年來，枯草芽孢桿菌的研究和使用發(fā)展極為迅速。紫外線作為物理誘變因子用于工業(yè)菌種的誘變處理具有悠久的歷史。目前為止，對于經誘變處理后得到的高單位抗生素產生菌中，有80%左右是通過紫外線誘變處理后經篩選而獲得的[1]。本文通過實驗來了解一下紫外線對枯草芽孢桿菌的誘變效應。

1 枯草芽孢桿菌及其應用

1.1 枯草芽孢桿菌的結構與生物學特征

枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種。單個細胞（0.7～0.8）×（2～3）μm，著色均勻。 無莢膜，周生鞭毛，能運動。 革蘭氏陽性菌，芽孢（0.6～0.9）×（1.0～1.5）μm，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭。需氧菌?？衫玫鞍踪|、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚?？莶菅挎邨U菌是一種無毒副作用、無殘留的綠色飼料添加劑。其產品中含有的活菌是以內生孢子的形式存在的，能耐酸、耐鹽、耐高溫及耐擠壓，在配合飼料制粒過程中以及通過酸性胃環(huán)境時比較穩(wěn)定。枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌為“公認安全（GRAS）”的細菌[2]。我國于1994年批準使用的益生菌有6種，芽孢桿菌就是其中之一。“促菌生”和“調痢生”均是國內較早研制成功的蠟樣芽孢桿菌微生態(tài)制劑[3]。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名[4]。通過分泌多種消化酶，芽孢桿菌能夠促進動物對飼料中營養(yǎng)物質的消化；通過分泌維生素及氨基酸等營養(yǎng)物質供動物利用，可以促進動物的生長；通過抑制動物體內的有害菌，可以起到預防動物疾病，優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境的作用[5]。

1.2 枯草芽孢桿菌的功能

生物奪氧；拮抗致病微生物，改善體內外生態(tài)環(huán)境；增強動物體的免疫功能；產生多種消化酶；產生多種營養(yǎng)物質。芽孢桿菌在動物腸道內生長繁殖，能產生多種營養(yǎng)物質如維生素、氨基酸、有機酸、促生長因子等，參與動物機體新陳代謝，為機體提供營養(yǎng)物質[6]。

1.3 紫外線的誘變作用

1.3.1 誘變的分類

物理誘變、化學誘變、空間技術誘變、復合誘變等[7]。

1.3.2 紫外線的特性

太陽光和人工光源中含有不可見的紫外線，紫外線是一種位于X射線和可見光波之間的電磁波，其波長在200～400 nm又稱紫外輻射[8]。

1.3.3紫外線的作用機理

紫外線是波長136～390 nm的短于紫外波長的射線，它是一種非電離輻射，能使被照射物質的分子或原子中的內層電子提高能級躍遷到能量高的外層軌道（稱為激發(fā)），導致分子的理化變化[9]。

1.3.4 紫外線的使用方法

測定紫外光的劑量有直接法 （以爾格/平方毫米表示絕對劑量）和間接法（以輻照時間或致死率作為相對劑量）兩種。一般用15W的紫外燈，距離固定在30 cm左右，選用致死率達90%～99.9%所需的輻射時間進行誘變處理。

輔射不宜在肉湯等成分復雜的液體中進行，以免化學反應的干擾；同時要有電磁攪拌設備，以求照射均勻，尤其在菌液濃度較大或菌體、孢子等較大而重時很容易在處理期間發(fā)生沉降，此時電磁攪拌更顯重要。照射前紫外燈宜先開燈預熱20～30 min，使光波穩(wěn)定[10]。

2 實 驗

2.1 材料與設備

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）；生理鹽水，牛肉膏，蛋白胨，瓊脂，氯化鈉，氫氧化鈉溶液；氯仿，液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[11]。

1 mL，5 mL移液管，燒杯，錐形瓶，酒精燈，磁力攪拌器，離心機，高壓滅菌鍋。

2.2 步驟

2.2.1 制備菌懸液

（1）取已培養(yǎng)48 h的活化枯草芽孢桿菌斜面4～5支，用無菌生理鹽水將菌苔洗下，并裝入盛有轉子的平皿中，放在磁力攪拌器上強烈振蕩，以打碎菌塊，使之攪拌均勻。

（2）將菌液離心（3 000 r/min）15 min,棄上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌2次，最后制成菌懸液。

（3）用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)。調整細胞數(shù)為108mL-1。

2.2.2 配制培養(yǎng)基

（1）制作液體和固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

（2）將固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基熔化后，冷至45℃左右倒平板，凝固后待用。

2.2.3 配制無菌生理鹽水

將氯化鈉0.9 g蒸餾水1 000 mL溶解，進行121℃，20 min高壓蒸汽滅菌，

2.2.4 紫外線處理

正式照射前開啟紫外燈預熱約20 min。分別取制備好的菌懸液3 mL移入5個直徑為6 cm的無菌培養(yǎng)皿中，在搖勻。15W紫外燈下30 cm處分別攪拌照射30，60，90，120，150 s。 不同誘變時間處理的菌懸液各取1 mL加入液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中37℃黑暗下培養(yǎng)24 h。同時取1 mL未經誘變的菌懸液培養(yǎng)作為對照。

2.2.5 涂平板

培養(yǎng)24 h后，在紅光（酒精燈光）下，分別取上述經誘變處理的菌懸液1 mL于裝于9 mL無菌水的試管中，搖勻；再從中吸取1 mL菌懸液，重復上個步驟，直至稀釋到10-4。用異步培養(yǎng)法[12]挑選高產單菌落。即將稀釋到10-5的菌懸液涂布平板，然后將其倒扣于裝有一薄層氯仿的培養(yǎng)皿蓋熏蒸50 min，讓菌落固定在固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面。移去培養(yǎng)皿蓋，讓平板中的氯仿?lián)]發(fā)40 min。 再取0.5 mL菌數(shù)為107～108mL-1的大腸桿菌菌懸液涂布在平板上。待平板晾干后培養(yǎng)72 h。

3 結果與討論

將培養(yǎng)72 h后的平板取出進行細胞計數(shù)。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計算出致死率，即

表1 照射時間與致死率對比結果

由圖1和圖2可以看出，枯草芽孢桿菌在15W，30M處紫外誘變不同時間，30 s時致死率最低，但其正突變率太小。隨時間的增加，致死率越來越大，150 s時菌種幾乎全部被殺死。60,90,120 s 3個時間段的致死率相差不大，其中在誘變時間為120 s時效果最好。在此時誘變菌株的抑菌圈最大，正突變率（誘變后抑菌圈比誘變前抑菌圈增大的比例）最高外，致死率也是可以接受的范圍。

4 結束語

本文只做了在不同時間的紫外線照射下枯草芽孢桿菌的致死率和對大腸桿菌的抑菌作用的關系，還可以通過實驗了解不同時間對抑菌效果的影響和不同接種量對抑菌效果的影響。

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Study of mutagenic effects of Bacillus subtilis using ultraviolet radiation

SUN Ai-jiea，SUN Ben-fengb，ZHAO Chun-jiea
（Heilongjiang Feihe Dairy Co.Ltd.,a.Key Laboratory；b.R&D Center（Beijing）,Qiqihar 161006,China）

Bacillus subtilis is a non-toxic and non-residual green feed additives.Research shows that Bacillus subtilis can be used for biological control or production of microbial fungicides to replace toxic chemicals.The use of UV-mutagenesis in Bacillus subtilis can achieve almost 100%death rate during experiment when treating 150 s.The mutagenic effect is the best when treating 120 s and the antibacterial effect against E.coli is most obvious.

Q936

A

1001-2230（2011）07-0012-03

2011-04-23

孫愛杰（1974-），女，助理工程師，從事乳品檢驗方面的研究。