毛細(xì)管電泳檢測發(fā)酵液中1，3-二羥基丙酮方法的建立

宋 煒魏勝華 黃蒙蒙 湯 斌 陶玉貴

（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，蕪湖 241000）

毛細(xì)管電泳檢測發(fā)酵液中1，3-二羥基丙酮方法的建立

宋 煒*魏勝華 黃蒙蒙 湯 斌 陶玉貴

（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，蕪湖 241000）

建立了利用毛細(xì)管電泳（CE）技術(shù)快速、準(zhǔn)確檢測發(fā)酵液中1，3-二羥基丙酮含量的新方法。所用熔融石英毛細(xì)管規(guī)格為50 μm×60 cm（有效長度為45 cm），分離電壓為24 kV，緩沖液為pH9.5的30 mmol/L硼砂緩沖溶液，200 nm處檢測DHA。結(jié)果表明，DHA標(biāo)準(zhǔn)樣品的遷移時(shí)間為8.3 min，在100 μg/mL～1 000 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.999 5），加樣回收率為97.79%，RSD為1.81%。測得以甘油作為底物發(fā)酵產(chǎn)DHA發(fā)酵液中DHA含量為3.220 g/L，此方法可有效應(yīng)用于產(chǎn)DHA發(fā)酵過程中產(chǎn)物的檢測。

1，3-二羥基丙酮；高效毛細(xì)管電泳；檢測

1，3-二羥基丙酮或二羥基丙酮（Dihydroxyacetone，簡寫DHA）外觀為白色粉末，具有特殊臭味，熔點(diǎn)為75℃～80℃（單體/二聚物的混合物），一般狀態(tài)下是二聚體（1，4-Dioxane）結(jié)晶,經(jīng)溶解或加熱則變?yōu)閱误w，可溶于水、乙醇、乙醚中。DHA是一種天然存在的水溶性酮糖，具有生物可降解性，可食用且對人體無害。DHA作為一種重要的化工原料、醫(yī)藥中間體和功能添加劑在國外已得到廣泛的實(shí)際應(yīng)用。

已報(bào)道DHA的分析方法有二苯胺顯色法、薄層色譜、紙層析、氣相色譜、高效液相色譜等方法，其中二苯胺顯色法由于操作需要顯色反應(yīng)，誤差相對較大，存在一定的局限性；薄層色譜分析法所用試劑昂貴且準(zhǔn)確定量困難；氣相色譜分析法衍生化過程復(fù)雜，需要大量的衍生化試劑；高效液相色譜所需儀器昂貴，樣品進(jìn)樣量大，檢測有所不便。與HPLC相比，CE應(yīng)用面廣，效率高，操作費(fèi)用和環(huán)境污染低，分析一個(gè)試樣僅需幾毫升流動液，越來越受到人們青睞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀，配備二極管陣列檢測器；熔融石英毛細(xì)管，50 μm×60 cm，河北省銳灃色譜器件有限公司，有效長度45 cm；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；微孔濾膜為孔徑0.45 μm，上海市新亞凈化器件廠；試驗(yàn)用水為雙蒸水，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 樣品

1，3-二羥基丙酮標(biāo)準(zhǔn)品（阿拉?。?，購于上海晶純試劑有限公司；待測樣品為產(chǎn)DHA菌種接種甘油發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，培養(yǎng)2 d后取發(fā)酵上清液。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面保藏培養(yǎng)基（按質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：甘油3%，酵母膏1%，碳酸鈣0.3%；種子培養(yǎng)基（按質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：甘油6%、酵母膏1%、碳酸鈣3%；發(fā)酵培養(yǎng)基（按質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：甘油6%、酵母膏1%、碳酸鈣3%、磷酸二氫鉀0.1%、無水硫酸鎂0.05%。

1.2 方法

1.2.1 毛細(xì)管電泳分析條件

熔融石英毛細(xì)管（總長度60 cm，有效長度45 cm）；運(yùn)行緩沖溶液：30 mmol/L硼砂緩沖溶液（加入0.1%NaOH調(diào)pH至9.5）；柱溫：25℃；進(jìn)樣壓力3.45 kPa，時(shí)間5 s；紫外檢測波長：200 nm，柱上檢測。清洗程序：2次進(jìn)樣之間用0.1 mol/L NaOH水溶液沖洗2 min，再用水沖洗2 min，最后用硼砂緩沖液沖洗2 min。

1.2.2 樣品處理

將實(shí)驗(yàn)室篩選到的可產(chǎn)DHA菌種從斜面保藏培養(yǎng)基接種到種子培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h，取5 mL接種至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵48 h后取樣，4 000 r/min離心15 min，將發(fā)酵液上清液稀釋數(shù)倍后用微孔濾膜過濾，所得濾液直接進(jìn)樣測定。

2 結(jié)果

2.1 毛細(xì)管電泳的條件優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

利用二極管陣列檢測器對1，3-二羥基丙酮進(jìn)行全波長掃描（190 nm～300 nm），在200 nm附近有最大吸收峰，基線較平穩(wěn)，因此選擇檢測波長為200 nm。

2.1.2 緩沖溶液pH的選擇

緩沖溶液的pH是影響毛細(xì)管電泳分離的首要因素。本試驗(yàn)配制40 mmol/L的硼砂緩沖液，用0.1 mol/L的NaOH分別調(diào)節(jié)其pH為9.1、9.3、9.5、9.7、9.9五個(gè)梯度，用于考察pH對分離效果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 緩沖溶液不同pH對分離效果的影響

由圖1可知，一定程度上，峰值越大，分離效果越好，當(dāng)pH9.5時(shí)，峰值達(dá)到最高值11 912 mAu，峰型較好，基線相對最平穩(wěn)。

2.1.3 緩沖溶液離子濃度的選擇

分別配制10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L的硼砂緩沖液（pH9.5） 系列對標(biāo)樣進(jìn)行測定，考察緩沖液的離子濃度對分離效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 緩沖液離子濃度對分離效果的影響

由圖2可知，緩沖液離子濃度為30 mmol/L時(shí)得到最大峰值，且基線十分平穩(wěn)。當(dāng)離子濃度達(dá)到40 mmol/L時(shí)，雖然基線也非常平穩(wěn)，但峰值有下降的趨勢，故采用離子濃度為30 mmol/L。

2.1.4 分離電壓的選擇

在pH為9.5、硼砂緩沖液離子濃度為30mmol/L條件下，考察了8 kV～24 kV電壓對二羥基丙酮標(biāo)樣保留時(shí)間的影響，見下頁圖3。

由圖3可知，隨著分離電壓的升高，保留時(shí)間減少，考慮到20 kV基線較穩(wěn)定，遷移時(shí)間適中，所以選擇20 kV作為分離電壓，在電壓為20 kV時(shí)，二羥基丙酮標(biāo)樣的保留時(shí)間約為8.3 min，可對二羥基丙酮進(jìn)行快速測定。

圖3 分離電壓對分離時(shí)間的影響

2.2 線性關(guān)系

精密稱取二羥基丙酮標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g，加雙蒸水定容至100 mL，即獲得1 000 μg/mL二羥基丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL置于10 mL容量瓶中定容得到100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL、800μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.2.1條件分別進(jìn)樣測定吸收峰值,以吸收峰值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4，并進(jìn)行線性回歸，得方程y=93.534x-866.35，標(biāo)準(zhǔn)曲線在 100 μg/mL～1 000 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.999 5。

圖4 毛細(xì)管電泳（CE）測定DHA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

以600 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2.1最佳電泳條件分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h測定峰面積，其RSD為1.93%，表明在10 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定，結(jié)果見表1。

表1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

以800 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述最佳電泳條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測峰值和遷移時(shí)間，計(jì)算RSD分別為0.96%、0.33%，表明精密度良好，結(jié)果見表2。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一菌株產(chǎn)的發(fā)酵液，按1.2.1最佳電泳條件分別測定，得到峰值和遷移時(shí)間的RSD分別為1.59%、0.39%，表明重現(xiàn)性良好，結(jié)果見表3。

表3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

分別精密量取已測定二羥基丙酮含量為3.220g/L的同一菌株產(chǎn)的發(fā)酵液9份，每份量取2 mL，分別準(zhǔn)確加入不同質(zhì)量濃度二羥基丙酮對照品溶液置于10 mL容量瓶中，加入雙蒸水定容至刻度，用0.45 μm微孔水膜過濾，按照上述最佳電泳條件測定，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果平均回收率為97.79%，RSD為1.81%，見表4。

表4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.7 樣品的測定

取3份發(fā)酵液在上述電泳條件下測定，對照品及樣品色譜圖如圖5，以所得的峰值帶入校準(zhǔn)曲線，計(jì)算供試樣液中DHA的含量，結(jié)果如表5所示。

表5 發(fā)酵液中DHA含量的測定結(jié)果（n=3）

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)酵液中DHA毛細(xì)管電泳圖對比

3 結(jié)論

建立了利用高效毛細(xì)管電泳法快速檢測發(fā)酵液中1，3-二羥基丙酮含量的方法，以pH9.5的30mmol/L硼砂溶液為緩沖溶液，分離電壓為24kV。該方法具有分離效果好、基線穩(wěn)定、干擾少、靈敏度高的特點(diǎn)。雖然發(fā)酵液成分復(fù)雜，在最佳檢測條件下可看到電泳圖譜中有雜峰帶出現(xiàn)，但是對于DHA仍具有較好的分離效果，分離度較高，可有效地將DHA與其他成分分離，為試驗(yàn)篩選產(chǎn)1，3-二羥基丙酮菌種以及進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)中1，3-二羥基丙酮的檢測打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

［1］ 張育川.二羥丙酮（DHA）［J］.精細(xì)與專用化學(xué)品，2003，11：（22）21.

［2］ 李堯.微生物發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.四川食品與發(fā)酵，2007，43（139）：20-23.

［3］ SOMMER K ，BOHLMANN U，BOHNET M.Production of dihydroxyacetone in a three phase fluidized bed reactor using gluconobacter oxydans ［J］.Chem.Eng.Technol.，1998，21（2）：144-149.

［4］ ROSARIA C，GIOVANNI P，CRISTINA D P，et al.One-pot electroactalytic oxidation of glycerol to DHA ［J］.Tetrahedron Letters，2006，47：6 993-6 995.

［5］ 張智宏，孫小娟.二羥基丙酮的氣相色譜分析［J］.分析測試學(xué)報(bào)，1999，18（3）：56-63.

［6］ 饒志明，徐美娟，沈微，等.高效液相色譜檢測發(fā)酵液中1，3-二羥基丙酮（DHA）方法的建立［J］.中國生物工程雜志，2008，28（1）：61-64.

［7］ 左華，趙寶祥，譚偉，等.1，3-二羥基丙酮衍生物的合成［J］.有機(jī)化學(xué)，2004，24（3）：331-333.

［8］ 陳義.毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［9］ 鄭裕國，張霞，沈寅初，等.微生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3-二羥基丙酮的菌株篩選［J］.浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，29（2）：124-127.

［10］ CLARETC，BORIES A，SOUCAILLE P.Glycerol inhibition of growth and dihydroxyacetone production by gluconobater oxydans［J］.Current Microbiology，1992，25（3）：149-155.

Determination of dihydroxyacetone in fermentation broth by capillary electrophoresis

SONGWei*WEI Sheng-huaHUANGMeng-mengTANGBinTAOYu-gui
（College ofbiological and chemical engineering，Anhui polytechnic university，Wuhu 241000，China）

A new rapid and accurate method to determine dihydroxyacetone in fermentation broth was developed by capillary electrophoresis with a fused-quartz capillary （50 μm ×60 cm，45 cm effective length）at detection wavelength of 200 nm and separation voltage of 24 kV.The buffer solution was 30mmol/L borax at pH9.5.The calibration curve was linear in the range from 100 μg/mL to 1 000 μg/mL （R2=0.999 5）for DHA with 3.220 g/L DHA in the fermentation broth was detected by HPLC.The average recovery was 97.79%with RSD of 1.81%.The method was applicable for DHA determination in the fermentation process.

dihydroxyacetone；capillaryelectrophoresis；determination

TS261.7

A

1673-6004（2011）04-0054-02

* 宋煒，男，1987年出生，安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院在讀碩士研究生。

2011-10-08