同時(shí)檢測(cè)兩種真菌毒素的膠體金試紙條的研制*

吳文曄 徐 煒 李 艷 舒文祥 周 堅(jiān)

（無(wú)錫安迪生物工程有限公司，無(wú)錫 214174）

·食品分析·

同時(shí)檢測(cè)兩種真菌毒素的膠體金試紙條的研制*

吳文曄**徐 煒 李 艷 舒文祥 周 堅(jiān)

（無(wú)錫安迪生物工程有限公司，無(wú)錫 214174）

目的：研究制備同時(shí)檢測(cè)黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）和赭曲霉毒素A（ochratoxinA，OA）兩種真菌毒素的膠體金快速檢測(cè)卡。方法：以人工合成抗原OVA-AFB1、OVA-OA和抗AFB1單克隆抗體、抗OA單克隆抗體為原料，用硝酸纖維膜和玻璃纖維紙作為載體，制作出同時(shí)檢測(cè)AFB1和OA的膠體金快速檢測(cè)卡。結(jié)果：該檢測(cè)卡能同時(shí)檢測(cè)AFB1和OA兩種真菌毒素，且兩者之間互不干擾，靈敏度均可達(dá)到2.5 μg/L，重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好。結(jié)論：成功制作出了能同時(shí)檢測(cè)兩種真菌毒素的快速檢測(cè)卡，一次操作能檢測(cè)兩種毒素，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)成本。

黃曲霉毒素B1；赭曲霉毒素A；單克隆抗體；膠體金

黃曲霉毒素（AFT） 是一類由黃曲霉菌和寄生曲霉菌中產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，均具有雙呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)慕Y(jié)構(gòu)，是世界衛(wèi)生組織公認(rèn)的致癌物。其中以B1的毒性和致癌性最強(qiáng)，M1、G1次之，B2、G2較弱。研究證實(shí)AFT具有極強(qiáng)的毒性和致癌性，其主要是損害動(dòng)物肝臟，引發(fā)動(dòng)物及人類的肝癌、腎癌和胃癌等；其次是具有細(xì)胞毒作用,并抑制機(jī)體的免疫機(jī)能。

赭曲霉毒素A（OA）是曲霉菌和青霉屬等產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的有毒代謝產(chǎn)物，是一種對(duì)肝臟和腎臟的強(qiáng)毒物質(zhì)，可以導(dǎo)致受試動(dòng)物的免疫抑制、腎萎縮、胎兒畸形、流產(chǎn)及死亡，并具有高度的致癌、致畸、致突變作用。這兩種毒素均可通過(guò)食物鏈在生物體之間轉(zhuǎn)移，因而不僅給農(nóng)民和家禽、家畜生產(chǎn)者造成經(jīng)濟(jì)上的損失，而且污染食品也對(duì)人類健康構(gòu)成威脅。

目前已建立的AFB1、OA 檢測(cè)方法有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜（HPLC）、免疫親和柱熒光光度法（IAC）、酶聯(lián)吸附法（ELISA）、金標(biāo)法（GICA） 等。TLC、HPLC、IAC這些方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確可靠、靈敏度高和重復(fù)性好等特點(diǎn)，但是要求對(duì)樣品進(jìn)行較繁瑣前處理，需要昂貴的儀器并耗費(fèi)大量人力，因此無(wú)法進(jìn)行大范圍推廣。ELISA具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但也存在需要專門儀器和耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。相比之下，金標(biāo)法（GICA）具有簡(jiǎn)單快速、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。目前有利用膠體金免疫層析方法單獨(dú)檢測(cè)AFB1或OA相關(guān)方面的研究，本文主要針對(duì)能夠同時(shí)檢測(cè)AFB1和OA兩種真菌毒素的膠體金快速檢測(cè)卡進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品、赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98.0 g/100g，Sigma公司；OVA-AFB1抗原、OVA-OA完全抗原、抗AFB1單克隆抗體、抗OA單克隆抗體：無(wú)錫安迪生物工程有限公司自制；羊抗鼠IgG：杭州隆基生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜）、玻璃纖維、樣品墊、吸水紙：上海金標(biāo)生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、聚乙二醇、氯金酸、檸檬酸三鈉、吐溫-20：均為分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；漩渦振蕩器SK-1、99-1A大功率數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海黃河儀表廠；點(diǎn)膜機(jī)、切條機(jī)：美國(guó)Bio-dot。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條的制備

用容量瓶量取200 mL超純水加入到500 mL錐形瓶中，將錐形瓶置于加熱板上，放入磁力攪拌器，打開(kāi)攪拌旋鈕至適當(dāng)速度。用移液器吸取2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的氯金酸溶液于上述200 mL超純水中，攪拌1 min，關(guān)閉攪拌旋鈕，打開(kāi)加熱旋鈕，加熱至沸騰。打開(kāi)攪拌旋鈕至適當(dāng)速度，快速加入經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的檸檬酸三鈉溶液0.8 mL，溶液在2 min內(nèi)由灰色變成黑色最后變成紅色，再繼續(xù)加熱攪拌10 min。關(guān)掉加熱旋鈕，適當(dāng)速度攪拌至室溫，定容到200 mL，4℃保存。

量取30 mL膠體金置于50 mL的小燒杯中，用0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)pH為8，磁力攪拌器攪拌均勻，同時(shí)加入300 μg抗AFB1單克隆抗體（制備OA的金標(biāo)抗體時(shí)為加入300 μg抗OA單克隆抗體）繼續(xù)攪拌20 min；緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的BSA至其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，繼續(xù)攪拌30 min，4℃冰箱靜置2 h；將上述膠體金溶液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，以8 000 r/min離心30 min，小心吸去上清液，沉淀放入4℃冰箱中備用。

沉淀適當(dāng)稀釋后用點(diǎn)膜機(jī)在玻璃纖維上噴金標(biāo)抗體，10 μL/cm，37℃干燥2 h以上。硝酸纖維膜上由上至下依次噴涂：（1）羊抗鼠IgG（1 mg/mL），此為質(zhì)控線；（2）OVA-OA完全抗原（1 mg/mL，0.01 mol/L pH7.4的CBS稀釋），此為檢測(cè)OA的檢測(cè)線 T1；（3）OVA-AFB1完全抗原 （1 mg/mL，0.01 mol/L pH7.4的CBS稀釋），此為檢測(cè)AFB1的檢測(cè)線T2，噴量均為1 μL/cm，37℃干燥30 min以上。將NC膜、膠體金墊、樣品墊和吸水紙依次組裝在底板上，用切刀切割成3.95 mm寬的試紙條裝入檢測(cè)卡中。

1.3.2 膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條的質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.3.2.1 試紙條的靈敏度試驗(yàn)

在加樣孔中加入75 μL樣品液，10 min后觀察結(jié)果。用試紙條測(cè)定質(zhì)量濃度分別為0 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.5 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L的AFB1和OA標(biāo)準(zhǔn)品, 每個(gè)濃度重復(fù)6次，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果判斷其敏感性。

1.3.2.2 試紙條的精密度試驗(yàn)

取不同批經(jīng)檢驗(yàn)合格的飼料、花生、玉米樣品各四份，粉碎后，每份樣品加入10 mL樣品抽提液，充分?jǐn)嚢杌旌希ㄖ辽? min），震蕩反應(yīng)30 min。4 000 r/min離心10 min，取上清，加入一定量的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，使得樣品抽提液中AFB1的終質(zhì)量濃度分別為 1.0 μg/L、2.5 μg/L、5.0 μg/L 和10.0 μg/L，用不同批次的6批真菌毒素二聯(lián)檢測(cè)卡，分別在6 d對(duì)這些樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)，檢驗(yàn)其重復(fù)性。

同理制備 OA 質(zhì)量濃度為 1.0 μg/L、2.5 μg/L、5.0 μg/L和10.0 μg/L的飼料樣、花生樣、玉米樣進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，步驟同上。

1.3.2.3 試紙條的穩(wěn)定性試驗(yàn)

試紙條和干燥劑一起用鋁箔袋密閉包裝，分別置4℃、室溫和37℃保存。4℃和室溫保存的試紙條每周各取出6條，分別用0μg/L標(biāo)準(zhǔn)品和2.5μg/L的AFB1和OA的標(biāo)準(zhǔn)品溶液檢測(cè)試紙條，觀察檢測(cè)線顏色的深淺以及NC膜上金標(biāo)抗體釋放程度。37℃保存的試紙條每天取出6條，用0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品和2.5 μg/L的AFB1和OA的標(biāo)準(zhǔn)品溶液檢測(cè)試紙條，觀察檢測(cè)線顏色的深淺以及NC膜上金標(biāo)抗體釋放程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 試紙條的靈敏度

檢測(cè)卡內(nèi)試紙條的主要反應(yīng)是免疫學(xué)的抗原和抗體反應(yīng)，在硝酸纖維素膜上遷移的膠體金標(biāo)記的抗體，分別與測(cè)試帶上的人工合成抗原OVA-AFB1、OVA-OA，以及質(zhì)控帶上羊抗鼠二抗反應(yīng)，形成棕紅色條帶。若樣品中有相應(yīng)的待檢AFB1和OA都高于允許值，當(dāng)樣品加入后即與相應(yīng)的抗體發(fā)生反應(yīng)，而不會(huì)與相應(yīng)的檢測(cè)帶所含的人工合成抗原OVA-AFB1、OVA-OA反應(yīng)，從而不顯色。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 真菌毒素二聯(lián)檢測(cè)卡對(duì)AFB1的靈敏度

從圖 1 （序號(hào) 1～7 分別表示 0 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、2.5 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液）可見(jiàn)，AFB1陰性時(shí)，真菌毒素二聯(lián)檢測(cè)卡相應(yīng)的檢測(cè)線出現(xiàn)明顯的紅色條帶；隨著AFB1標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加，檢測(cè)線T2條帶逐漸減弱，當(dāng)質(zhì)量濃度增至2.5 μg/L時(shí)，檢測(cè)線T2無(wú)紅色條帶出現(xiàn)，質(zhì)控線C和檢測(cè)線T1出現(xiàn)深紅色條帶。由此判斷該檢測(cè)卡對(duì)AFB1的靈敏度為2.5μg/L。

圖2 真菌毒素二聯(lián)檢測(cè)卡對(duì)OA的靈敏度

從圖 2 （序號(hào) 1～7 分別表示 0 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、2.5 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L的OA標(biāo)準(zhǔn)品溶液）可見(jiàn)，OA陰性時(shí)，真菌毒素二聯(lián)檢測(cè)卡相應(yīng)的檢測(cè)線出現(xiàn)明顯的紅色條帶；隨著OA標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加，檢測(cè)線T1條帶逐漸減弱，當(dāng)質(zhì)量濃度增至2.5 μg/L時(shí)，檢測(cè)線T1無(wú)紅色條帶出現(xiàn)，質(zhì)控線C和檢測(cè)線T2出現(xiàn)深紅色條帶。由此判斷該檢測(cè)卡對(duì)OA的靈敏度也為2.5 μg/L。且AFB1和OA兩者之間互不干擾。

2.2 試紙條的精密度

試紙條精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下頁(yè)表1、表2。由表1、表2可知，不同批次的6批真菌毒素二聯(lián)檢測(cè)卡對(duì)飼料樣、花生樣、玉米樣的檢測(cè)結(jié)果完全一致，證明不同批次生產(chǎn)的真菌毒素二聯(lián)檢測(cè)卡檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，具有良好的重復(fù)性。

2.3 試紙條的穩(wěn)定性

試紙條在37℃條件下保存到14 d、在4℃保存14個(gè)月和室溫保存1 a，檢測(cè)0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)控線和檢測(cè)線顯色仍很清晰，結(jié)合墊上金標(biāo)記物釋放完全；檢測(cè)2.5 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)質(zhì)控線顯色清晰，檢測(cè)線完全抑制，能滿足正常檢測(cè)要求。最后確定試紙條密封干燥下4℃至少可保存14個(gè)月，室溫條件下可保存1 a。

3 結(jié)論

GB2761-2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中規(guī)定，AFB1在玉米、花生、花生油、玉米油中的限量標(biāo)準(zhǔn)為20 μg/kg，在稻谷、植物油脂中的限量標(biāo)準(zhǔn)為10 μg/kg，在小麥、豆類、堅(jiān)果中的限量標(biāo)準(zhǔn)為5 μg/kg。OA在谷物、豆類中的限量標(biāo)準(zhǔn)為 5 μg/kg。

本檢測(cè)卡把靈敏度確定為2.5 μg/L。由于真菌毒素二聯(lián)檢測(cè)卡是采用競(jìng)爭(zhēng)原理設(shè)計(jì)的，因此膠體金標(biāo)記抗體量尤為關(guān)鍵，標(biāo)記抗體量過(guò)多，靈敏度就會(huì)降低，達(dá)不到應(yīng)用價(jià)值；而標(biāo)記抗體量過(guò)少，盡管能提高靈敏度，但會(huì)使陰性顯色條帶較淡，不易與陽(yáng)性進(jìn)行比較。本試驗(yàn)中采用不同的抗體標(biāo)記量和不同的抗原包被量之間進(jìn)行正交試驗(yàn)，從而確定最佳的標(biāo)記量和包被量，使得真菌毒素二聯(lián)檢測(cè)卡對(duì)AFB1和OA的最低檢測(cè)限均能達(dá)到2.5 μg/L。

表1 不同批次檢測(cè)試紙對(duì)AFB1的精密度試驗(yàn)（n=6）μg/L

表2 不同批次檢測(cè)試紙對(duì)OA的精密度試驗(yàn)（n=6）

將兩項(xiàng)毒素指標(biāo)集成在一個(gè)試紙條上，首先要保證兩者之間沒(méi)有干擾性，從AFB1和OA兩者的化學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)看（見(jiàn)圖3、圖4），兩者差異很大，這就保證了他們各自的抗原和抗體能特異性地結(jié)合，而不會(huì)對(duì)另一方產(chǎn)生干擾。

圖3 曲霉毒素B1結(jié)構(gòu)圖

圖4 曲霉毒素A結(jié)構(gòu)圖

本試驗(yàn)成功將兩項(xiàng)毒素檢測(cè)集合在一個(gè)試紙條上，一次操作即能檢測(cè)兩種真菌毒素，即節(jié)省了檢測(cè)成本，又降低了檢測(cè)的勞動(dòng)強(qiáng)度，且靈敏度高、特異性好，具有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。

［1］ BRESLOW N，CHAN C W，DHOM G，et al．IARC monograps on the evalation of cancinogenic risk tu humans［M］．Lyon，F(xiàn)rance：World Health Oranisation．2002．

［2］ CARLSON M A ，BARGERON C B，BENSON R C.An automated，handheld biosensor for aflatoxin［J］．Biosens Bioelectron，2000（14）：841-848．

［3］ RODRIGUEZVELASCO M L，CALONGE DELSO M M ，ORDONEZESCUDERO D.ELISA and HPLC determination of the occurrence of aflatoxin M1 in raw cow's milk［J］．Food Additives&Contaminants，2003，20（3）：276-280．

［4］ 林怡，黎樂(lè)群，彭濤，等.AFTB1代謝及致肝癌機(jī)制的研究進(jìn)展［J］．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2007，9（12）：131-133．

［5］ 陳愛(ài)民，徐耀初.AFT致肝癌的分子機(jī)制及其化學(xué)預(yù)防［M］．國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，1998，25（5）：285-288.

［6］ 卿中全，于炎湖.AFT對(duì)家禽生產(chǎn)性能和健康的影響［J］.中國(guó)飼料，2000（3）：35-37

［7］ MISHRA H N，CHITANGADA DAS.A review on biological control and metabolism of aflatoxin ［J］.Critical Reviews in Food Science and Nuteition，2003，43（3）：245-264.

［8］ 馬志科，昝林森.AFT危害、檢測(cè)方法及生物降解研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（9）：91-94

［9］ ABARCA M L，BRAGULAT M R，CASTELLA G，et al.Ochratoxin A production by strains of aspergillus niger var.niger［J］.ApplEnvironMicrobiol，1994，60（7）：2650-2652.

［10］ FINK-GREMMELS J，JAHN A，BLOM M J，et al.Toxicity and metabolism of ochratoxin A［J］.Natural Toxins，1995，3（4）：214-220.

［11］黃彪，張連芬，陶文沂，等.赭曲霉毒素A的高靈敏度時(shí)間分辨熒光免疫分析［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005，32（7）：662-666.

［12］何暈，張琳.高效液相色譜法測(cè)定飼料中的黃曲霉毒素［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2009，31（2）：23-24.

［13］劉朝暉，楊冀州，楊向瑩.免疫親和柱熒光光度法在檢測(cè)黃曲霉素中的應(yīng)用［J］.檢疫檢驗(yàn)，2000，21（11）：32.

［14］龔燕，蔡建榮，趙曉聯(lián)，等.ELISA法檢測(cè)紅曲中的黃曲霉毒素 B1［J］.無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23（4）：10-12.

［15］鄧省亮，賴衛(wèi)華，許楊.膠體金免疫層析法快速檢測(cè)黃曲霉毒素 B1 的研究［J］.食品科學(xué)，2007，28（2）：232-236.

［16］賴衛(wèi)華，熊勇華，陳高明.應(yīng)用膠體金試紙條快速檢測(cè)赭曲霉毒素 A 的研究［J］.食品科學(xué)，2005，26（5）：204-207.

Developing gold immunochromatography assay for simultaneously rapid detection ofaflatoxin B1 and ochratoxin A

WUWen-ye**XUWeiLI YanSHUWen-xiangZHOUJian
（Wuxi antixbiotech company，Wuxi 214174，China）

Objective：To develop gold immunochromatography assay for simultaneously rapid detection of aflatoxin B1（AFB1） and ochratoxinA（OA）.Methods：Synthetic antigen OVA-AFB1，OVA-OA and anti-AFB1monoclonal antibody,anti-OA monoclonal antibody were used as raw material，nitrocellulose membrane and glass fiber paper as a carrier to produce a mycotoxins test strip which can detect AFB1and OA.Results：The results showed that the test strip can simultaneously detect AFB1and OA,and there's no interference AFB1and OA，the sensitivity of the test strip can reach 2.5 μg/L.Conclusion：A mycotoxins test strip which can simultaneously detect two kinds of fungi toxins was successfully produced,which was featured with one operation could detect both toxins to save test time and cost.

aflatoxinB1； ochratoxinA； monoclonal antibody； colloidal gold；test strip

TS261.1+2

A

1673-6004（2011）04-0052-02

國(guó)家科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金（10c262132 01075）

**吳文曄，女，1984年出生，2008年畢業(yè)于江南大學(xué)微生物與生化藥學(xué)專業(yè)，碩士。

2011-09-30