牙髓干細(xì)胞研究進展

干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增生能力和多相分化潛能的細(xì)胞，能夠產(chǎn)生高度分化的功能細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。目前，已在體外成功地擴增出人體多種組織的成體干細(xì)胞，自從2000年Gronthos等[1]發(fā)現(xiàn)人牙髓組織中存在成體干細(xì)胞即牙髓干細(xì)胞( dental pulp stem cells，DPSCs)后 ，近十年來國內(nèi)外學(xué)者對牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)、生物學(xué)特性、細(xì)胞表型、分化能力及重組為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）等方面已進行了大量研究，本文就牙髓干細(xì)胞的研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 DPSCs的發(fā)現(xiàn)和生物學(xué)特性

牙髓是結(jié)締組織，位于牙齒髓室和根管內(nèi)，有一定修復(fù)再生的能力。由于成牙本質(zhì)細(xì)胞是一種終末細(xì)胞，一旦分化后就不再分裂，因此普遍認(rèn)為在成牙本質(zhì)細(xì)胞遭受損傷后，牙髓內(nèi)存在的未分化前體細(xì)胞可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，并分泌細(xì)胞基質(zhì)。但直到2000年，Gronthos等[1]才首次正式提出DPSCs的概念，把具有克隆形成能力的高增殖率的牙髓細(xì)胞命名為DPSCs，在試驗中應(yīng)用酶消化法對成人第三磨牙牙髓細(xì)胞進行體外培養(yǎng)，并與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞( bone marrow stromal cells， BMSCs)進行比較，結(jié)果表明，這兩種細(xì)胞具有相似的免疫表型，但DPSCs具有更高的克隆形成率和增生率，經(jīng)體外誘導(dǎo)后能形成分散而高密度的鈣化小結(jié)，當(dāng)將DPSCs與HA /TCP支架共同培養(yǎng)后回植到小鼠背側(cè)皮下，能觀察到類似牙本-牙髓復(fù)合體樣的結(jié)構(gòu)。Miura等[2]發(fā)現(xiàn)人脫落乳牙(stem cells from human exfoliated deciduous teeth， SHED)的牙髓中含有多能干細(xì)胞，具有高度增殖和克隆形成的特性，當(dāng)將體外擴增的DPSCs 和SHED 與羥磷灰石/磷酸三鈣(hydroxyapatite/tricalcium phosphate， HA/TCP)聯(lián)合植入免疫缺陷小鼠的皮下時可形成牙本質(zhì)- 牙髓樣結(jié)構(gòu)。Young等[3]分離豬第三磨牙牙胚，制備單細(xì)胞懸液，并接種到可降解的聚合物支架上，植入大鼠腸系膜內(nèi)生長20～30周，可成功地構(gòu)建出牙齒結(jié)構(gòu)，包括含成熟牙釉質(zhì)的釉器官、牙本質(zhì)、成牙本質(zhì)細(xì)胞、髓室、上皮根鞘和成牙骨質(zhì)細(xì)胞，證實了在豬第三磨牙有上皮和間充質(zhì)干細(xì)胞的存在。

DPSCs 在形態(tài)上類似人骨髓成纖維細(xì)胞集落形成單位（colony forming unit fibroblast，CFU-F）[1]，大多數(shù)細(xì)胞呈長梭形，體積較小。透射電鏡下，DPSCs 的核呈卵圓形，約占胞體體積的80%～90%，核仁大而明顯，常染色質(zhì)居中，異染色質(zhì)少，分布于核周。胞漿很少，核漿比例大。細(xì)胞器較少，核糖體豐富，這些形態(tài)特征也體現(xiàn)了DPSCs的未分化或低分化狀態(tài)。自我更新是干細(xì)胞的重要特性， Gronthos等[4]從3個月的原代DPSCs移植物中分離出基質(zhì)樣細(xì)胞，在體外培養(yǎng)擴增后植于小鼠皮下，結(jié)果形成牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)。對形成的牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)進行免疫組化檢測， 發(fā)現(xiàn)其牙本質(zhì)涎蛋白(dentin sialo protein，DSP)表達陽性，證實DPSCs具有自我更新能力。多向分化能力也是干細(xì)胞的特征之一，在不同的微環(huán)境下，DPSCs 可分化為多種細(xì)胞，礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，DPSCs能夠形成與前期牙本質(zhì)相似的球狀礦化基質(zhì)并表達成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）[5]；在脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，DPSCs培養(yǎng)物中出現(xiàn)油紅“O”陽性的脂滴，并伴隨脂肪細(xì)胞特異性的pparγ2 和lpl基因表達上調(diào)；此外，DPSCs 還在mRNA 和蛋白水平表達神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志：神經(jīng)巢蛋白（ nestin）和神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（ glial fibrillary acid protein，GFAP），這說明體外培養(yǎng)的DPSCs有向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的潛能[5]。其他學(xué)者也成功地誘導(dǎo)了DPSCs 向成牙本質(zhì)細(xì)胞、肌管樣細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞的分化[6-7]。

2 DPSCs的定位、分離和鑒定

Gronthos等[1]推測DPSCs可能來源于血管周圍的微環(huán)境(perivascular niche)。Shi等[8]研究發(fā)現(xiàn)，DPSCs和BMSCs存在于它們起源組織的微血管周圍。Tecles等[6]選取拔除的根尖孔未形成的第三磨牙分為三組：一組制備累及牙本質(zhì)的淺洞，一組制備暴露牙髓的深洞，一組不做處理，分別觀察牙髓內(nèi)干細(xì)胞的活化和遷移，結(jié)果表明血管周圍存在干細(xì)胞。干細(xì)胞表面的分子標(biāo)記是鑒定和研究干細(xì)胞功能的重要手段，目前發(fā)現(xiàn)明確的干細(xì)胞標(biāo)記不多，對DPSCs的標(biāo)記物研究也不夠深入。Gronthos等[1]應(yīng)用免疫組化技術(shù)研究DPSCs的表面分子標(biāo)記，并與BMSCs比較。結(jié)果表明，均表達與內(nèi)皮細(xì)胞(血管細(xì)胞粘附分子1、CD146)、平滑肌細(xì)胞(α2平滑肌肌動蛋白)、骨細(xì)胞(堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原、骨連接素、骨橋素、骨鈣素)和成纖維細(xì)胞(Ⅲ型膠原、成纖維細(xì)胞生長因子2)有關(guān)的分子標(biāo)記。DPSCs不表達骨基質(zhì)蛋白、骨涎蛋白，而在BMSCs為低水平表達。用Northern blotting方法研究發(fā)現(xiàn)DPSCs不表達成牙本質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物牙本質(zhì)涎磷蛋白( dentin sialophosphop rotein， DSPP)，說明DPSCs處于未分化狀態(tài)，尚未分化為成熟的成牙本質(zhì)細(xì)胞。為進一步比較DPSCs和BMSCs的性質(zhì)，Shi等[7]應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究DPSCs和BMSCs的基因表達情況，發(fā)現(xiàn)兩者在人類將近4 400個基因表達水平上是一致的，包括表達細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞粘附分子、生長因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等的基因。但同時發(fā)現(xiàn)，DPSCs較高表達ⅩⅤⅢα1型膠原、胰島素樣生長因子2、盤狀結(jié)構(gòu)域酪氨酸激酶、NAD ( P) H2維生素K3氧化還原酶、周期素依賴性蛋白激酶6等；BMSCs較高表達胰島素樣生長因子連接蛋白27和Ⅰα2型膠原。Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，DPSCs分化時，初始Runx2、TGFβ相關(guān)基因、膠原代謝相關(guān)基因上調(diào)、堿性磷酸酶活性上升，后均下降；而細(xì)胞外基質(zhì)磷糖蛋白(matrix extracellular phosphoglyco protein， MEPE)是DPSCs分化過程中唯一下降的標(biāo)記物，作者認(rèn)為MEPE是礦化的抑制劑，在DPSCs分化時下調(diào)，可作為DPSCs分化時的檢測指標(biāo)。最近Mokry 等[10]研究表明，牙髓干細(xì)胞表達STRO-1、vimentin、CD29、CD44、CD73、CD90、CD166等間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)志物，同時表達Sox2， nestin及 nucleostemin干細(xì)胞標(biāo)志物。

3DPSCs的多向分化能力與相關(guān)因素的調(diào)控

牙髓干細(xì)胞是來源于神經(jīng)嵴和間充質(zhì)的多潛能干細(xì)胞[11]，研究發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞群主要是來源于神經(jīng)嵴細(xì)胞群，細(xì)胞標(biāo)志物為low affinity nerve growth factor receptor (LANGFR)和間葉細(xì)胞群，標(biāo)志物為1-integrin receptor subunit。這兩個細(xì)胞群都具有多向分化的功能。牙髓干細(xì)胞的多項分化能力即可塑性(plasticity)在國內(nèi)外的很多實驗中得到驗證。Yu等[12]認(rèn)為牙髓干細(xì)胞的分化方向取決于局部的微環(huán)境，他們在試驗中發(fā)現(xiàn)利用豬牙胚細(xì)胞條件培養(yǎng)基能誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞形成更加合理組織學(xué)結(jié)構(gòu)的牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體。Iohara等[13]研究發(fā)現(xiàn)，BMP2能夠刺激牙髓細(xì)胞分化為表達牙本質(zhì)涎磷蛋白DSPP的成牙本質(zhì)細(xì)胞。Saito等[14]也發(fā)現(xiàn)，BMP2能促進牛和人單層培養(yǎng)和三維膠丸培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞。Keklikoglu等[15]認(rèn)為轉(zhuǎn)化因子AP21家族的成員FosB在成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙髓未分化間充質(zhì)細(xì)胞的分化和增生方面有重要作用。Moioli等[16]的研究，TGF2β能誘導(dǎo)DPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。Liu等[17]研究表明牙本質(zhì)素是MEPE的一個肽片段，它能下調(diào)P16，促進DPSCs的增生，在牙髓修復(fù)中扮演重要角色。Gronthos等[1]發(fā)現(xiàn)DPSCs在含有L2抗壞血酸22磷酸、地塞米松、無機磷酸鹽的礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～6周后，經(jīng)染色表明有鈣結(jié)節(jié)形成。Yamada 等[18]的研究表明，人DPSCs高表達DMP1，而DMP1在未分化間充質(zhì)細(xì)胞分化和牙本質(zhì)礦化中起重要作用。Arthur 等[19]體內(nèi)和體外實驗中，分別加入了各種生長因子如EGF及FGF等，均發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞可以分化為具有功能活性的神經(jīng)元。Francesca Paino等[20]認(rèn)為黑素細(xì)胞和牙髓細(xì)胞均源于神經(jīng)嵴細(xì)胞群，在試驗中DPSCs在沒有外加定向誘導(dǎo)因素下，表達TRP-2、TRP-1、gp100/Pmel and MART-1抗原，且能自主分化為完全成熟的黑素細(xì)胞。Demarco 等[21]最近研究把三維多聚乳酸支架置于拔除的第三磨牙髓室內(nèi)，用晶體鹽或膠體做成孔劑輔料，把牙髓干細(xì)胞接種于其內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與牙本質(zhì)相關(guān)的形態(tài)發(fā)生因子在誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化中起著重要的作用，且DPSCs的微環(huán)境對細(xì)胞的行為和分化也有重要的影響。Jing WANG等[22]用納米纖維多聚乳酸支架進行DPSCs體內(nèi)體外定向分化研究，發(fā)現(xiàn)BMP-7 和 DXM復(fù)合因子及納米纖維多聚乳酸支架可大大提高DPSCs向牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的定向分化能力。Gronthos等[23]實驗成功對DPSCs進行了脂肪誘導(dǎo)，而Norsat等[24]證明DPSCs具有神經(jīng)分化分化能力。

4DPSCs向 iPSCs 的重組轉(zhuǎn)化

誘導(dǎo)多潛能性干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是通過在分化的體細(xì)胞中表達特定的轉(zhuǎn)錄因子，以誘導(dǎo)體細(xì)胞的重編程而獲得的可不斷自我更新且具有多向分化潛能的細(xì)胞。由于iPSCs既避免免疫排斥，又不涉及倫理道德問題，因此具有廣泛且重要的臨床應(yīng)用價值。在2006年日本學(xué)者Takahashi和Yamanaka[25]研究小組采用體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)， 從24個因子中篩選出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4個轉(zhuǎn)錄因子， 通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將上述4個轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入胚胎小鼠成纖維細(xì)胞或成年小鼠尾部皮膚成纖維細(xì)胞， 在小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng)條件下獲得了Fbx15+的多潛能干細(xì)胞系， 該細(xì)胞系在細(xì)胞形態(tài)、生長特性、表面標(biāo)志物、形成畸胎瘤等方面與小鼠ES細(xì)胞非常相似， 而在基因表達譜、DNA甲基化方式及形成嵌合體動物方面卻不同于小鼠ES細(xì)胞， 故將其命名為iPSCs，從那開始全世界眾多實驗室開始了iPSCs研究[26-28]，相繼從狗、豬、猴和人等哺乳動物的皮膚細(xì)胞、肝細(xì)胞、羊水細(xì)胞、CD34血細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞及牙齒干細(xì)胞等成體細(xì)胞成功獲得了iPSCs。其中牙髓組織在臨床上易于獲得，不牽涉?zhèn)惱韱栴}而得到廣泛關(guān)注。Tamaoki[29]和Xing YAN等[30]研究小組利用病毒載體把c-Myc、Klf4、 Oct4、 Sox2 和Lin28、Nanog、Oct 4、 Sox2因子導(dǎo)入牙髓干細(xì)胞中，成功獲得了iPSCs。

迄今為止，關(guān)于DPSCs的研究，國內(nèi)外學(xué)者做了大量的工作，取得了很大的進展。但是DPSCs的研究仍面臨許多問題，如DPSCs有無特異性細(xì)胞標(biāo)志物? DPSCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)? DSPCs的潛在分化能力和如何定向誘導(dǎo)DPSCs的分化? Telomere在DPSCs體外培養(yǎng)和體內(nèi)增殖過程中的作用機制？DPSCs向 iPSCs的成功轉(zhuǎn)化載體和重組因子的優(yōu)化？這些問題說明DPSCs應(yīng)用于臨床還有很長的路要走，需要相關(guān)學(xué)者更多的基礎(chǔ)和臨床研究。

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[收稿日期]2010-11-29 [修回日期]2011-02-10

編輯/李陽利