供者未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞聯(lián)合西羅莫司誘導(dǎo)大鼠皮膚移植物免疫耐受研究

[摘要]目的：觀察大鼠骨髓來(lái)源的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(imDCs)聯(lián)合西羅莫司(SRL)在誘導(dǎo)大鼠同種異體皮膚移植免疫耐受中的協(xié)同作用。方法：以雄性Lewis大鼠為供者、Brown-Norway大鼠為受者，建立大鼠同種異體皮膚移植模型。對(duì)照（control）組術(shù)前不給予任何干預(yù)；未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(imDCs)組于術(shù)前7天經(jīng)尾靜脈注射供者骨髓來(lái)源的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞；西羅莫司(SRL)組于術(shù)后連續(xù)7天經(jīng)胃管灌注西羅莫司；聯(lián)合(imDCs+SRL)組于術(shù)前7天經(jīng)尾靜脈注射供者骨髓來(lái)源的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞，并于術(shù)后連續(xù)7天經(jīng)胃管灌注西羅莫司。結(jié)果：對(duì)照組、未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(imDC)組、西羅莫司(SRL)組、聯(lián)合(imDCs+SRL)組大鼠同種異體皮膚移植物術(shù)后存活時(shí)間分別為(8.25±1.75)、(10.25±1.91)、(10.64±2.50)、(21.38±2.97)天。方差分析提示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；S-N-K檢驗(yàn)提示除單獨(dú)應(yīng)用未成熟DC組與單獨(dú)應(yīng)用SRL組外，各組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：供者骨髓來(lái)源未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞可誘導(dǎo)大鼠同種異體皮膚移植免疫耐受；聯(lián)合使用西羅莫司可延長(zhǎng)移植皮片成活時(shí)間。

[關(guān)鍵詞]西羅莫司；未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞；皮膚移植；大鼠

[中圖分類號(hào)]R622Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2011）02-0232-03

Induced immune tolerance to rat skin allograft by dornor immature dendritic cells and sirolimus

ZHANG Zi-xi，YANG Yang，XIA Wei，GUO Shu-zhong

(Institute of Plastic Surgery，Xijing Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of donor immature dendritic cells (imDCs) and sirolimus (SRL) on the induced immune tolerance to rat skin allograft.MethodsThe recipient Brown-Norway rat receiving transplantation of skin allograft from Lewis rat were divided into control group(without perioperative treatments)，immature DC group (receiving injection of donor immature DC via tail vein 7d before skin transplantation)，sirolimus (SRL) group (receiving injection of sirolimus for 7 consecutive days after transplantation)，sirolimus (SRL) combined immature DC group (receiving injection of donor immature DC 7d before transplantation and sirolimus for 7 consecutive days after transplantation).ResultsThe survival time of the skin allograft in the control，immature DC，sirolimus (SRL) combined immature DC group groups were (8.25±1.75)、(10.25±1.91)、(10.64±2.50)、(21.38±2.97) d， respectively， showing significant diferences among the groups (P＜0.05)，and SNK test also indicated significant differences between each two groups． ConclusionsSirolimus (SRL) and donor immature DC have synergic effects in inducing skin allograft tolerance and prolonging survival time of skin allograft in rat．

Key words:sirolimus; dendritic cells; immune tolerance; rat; skin transplantation

樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic Cells，DC)是一種專職的抗原提呈細(xì)胞，其最顯著的特點(diǎn)是可以激活初始T細(xì)胞，是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)者[1]。而未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(Immature D endritic Cells，imDCs)由于不能活化T細(xì)胞而導(dǎo)致T細(xì)胞的低反應(yīng)性，所以成為移植免疫耐受的研究熱點(diǎn)[2]。未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞作為免疫耐受的誘導(dǎo)劑，可成功誘導(dǎo)免疫低反應(yīng)狀態(tài)[3]。西羅莫司(Sirolimus，SRL)為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，同時(shí)也是一種新型免疫抑制劑，在預(yù)防和治療器官移植后的排斥反應(yīng)中有顯著作用[4]。移植術(shù)后大劑量使用免疫抑制劑的毒副作用移植成為焦點(diǎn)，如何使用低毒無(wú)害的免疫抑制方案一直是目前研究的重點(diǎn)，聯(lián)合給藥或其他給藥途徑被證明可以明顯減少毒副作用[5-6]。以往研究認(rèn)為SRL主要通過(guò)作用于T淋巴細(xì)胞而發(fā)揮免疫抑制作用，但近期研究表明SRL可作用于DC分化發(fā)育的不同環(huán)節(jié)，調(diào)節(jié)DC生物學(xué)功能[7-8]。為了進(jìn)一步研究SRL是否可協(xié)同未成熟DC誘導(dǎo)受者免疫耐受，在本研究中我們使用供者未成熟DC對(duì)皮膚移植受者進(jìn)行預(yù)處理，于術(shù)后聯(lián)合使用SRL，觀察移植皮片存活時(shí)間， 探討未成熟DC聯(lián)合SRL在誘導(dǎo)同種異體皮膚移植免疫耐受中的效果。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑：本實(shí)驗(yàn)使用Brown-Norway大鼠(BN，RT1n)和Lewis大鼠(LEW，RT11)，均為雄性，8～10周齡，150～220g；其中Brown Norway鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，Lewis大鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，。西羅莫司口服液購(gòu)自Wyeth公司。重組鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)及重組鼠白細(xì)胞介素4(rmlL-4)購(gòu)自Peprotech公司。RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品。

1.2 未成熟DC的制備： 無(wú)菌操作下收集BN大鼠股骨的骨髓細(xì)胞，用Tris-NH4C1緩沖液溶解紅細(xì)胞，RPMI 1640洗滌2次后重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，再置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2ml。在37℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、95%濕度環(huán)境下培養(yǎng)3h。吸棄上清液，再用37℃預(yù)溫的RPMI 1640輕輕洗去非貼壁細(xì)胞，每孔加人RPMI 1640(含胎牛血清100ml/L、rmGM-CSF 10μg/L、rmIL 42μg/L、Hepes10mol/L、青霉素1000 U/ml、鏈霉素1000 U/m1)培養(yǎng)基2ml，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔一天半量換液。7天后，反復(fù)吹吸收集疏松粘附細(xì)胞及懸浮細(xì)胞，即為未成熟DC。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)予以鑒定。

1.3 大鼠異體皮膚移植模型：以BN大鼠為供體，LEW 大鼠為受體。供體腹腔內(nèi)注射50mg／kg戊巴比妥鈉麻醉，于其軀干背部以剪去全層皮膚一塊，刮盡皮肌，修剪成中厚皮，制成直徑1cm的圓形皮片，修剪成中厚皮；受體同樣方法麻醉后，背部胸腹交界處剃毛，皮膚消毒，用眼科剪刀以鉗夾法剪去全層皮膚一塊，形成約1cm2的圓形創(chuàng)面，勿傷及皮肌。將供者皮膚貼于創(chuàng)面處，間斷縫合皮膚邊緣，打包包扎，注意移植皮片毛的方向與受者毛的方向相反。5天后打開(kāi)包扎，觀察皮片的存活情況，皮片變黑壞死脫落或全部形成干痂為皮片死亡。移植術(shù)前對(duì)LEW大鼠肌肉注射青霉素鈉2萬(wàn)U／kg；術(shù)后再注射1萬(wàn)U／kg，2次／天，共3天。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)：隨機(jī)將32只LEW 受體大鼠分為4組(每組8只)，32只BN供體大鼠分為4組(每組8只，對(duì)應(yīng)分配于3組受體移植大鼠)。①對(duì)照(control)組：術(shù)前不給予任何干預(yù)措施；②未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(imDCs)組：于術(shù)前7天經(jīng)尾靜脈注射供者骨髓來(lái)源的imDCs 2×106個(gè)/只；③西羅莫司(SRL)組：于術(shù)后連續(xù)7天經(jīng)胃管灌注SRL 3mg.kg-1.d-1；④聯(lián)合(imDCs+SRL)組：使用imDCs于術(shù)前7天經(jīng)尾靜脈注射，術(shù)后連續(xù)7天經(jīng)胃管灌注SRL，用法同imDCs組及SRL組。

1.5 移植皮片病理學(xué)觀察及排斥反應(yīng)分級(jí)：于移植術(shù)后第7天分別取各組大鼠的移植皮片，用40g/L的多聚甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋組織，切片后HE染色，光鏡下觀察皮片病理變化。鏡下皮片的排斥反應(yīng)分級(jí)參照文獻(xiàn)[9]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0，以方差分析檢驗(yàn)各組均數(shù)問(wèn)的差異，如果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，S-N-K檢驗(yàn)進(jìn)一步行多重比較。

2結(jié)果

2.1 未成熟DC形態(tài)學(xué)檢測(cè)：未成熟DC培養(yǎng)24h后，光鏡下可見(jiàn)貼壁的單核細(xì)胞均勻分布。3天后大量的細(xì)胞疏松的貼附于板壁上呈簇狀生長(zhǎng)。5天后細(xì)胞集落增多，呈懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面有星狀毛刺疏松粘附細(xì)胞即為未成熟DC。

2.2 移植皮片病理學(xué)觀察：各組移植術(shù)后第7天移植物排斥反應(yīng)分級(jí)。①對(duì)照（control）組：鏡下觀察，移植皮片表皮層斷裂，腺體結(jié)構(gòu)消失，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，分級(jí)為Ⅳ級(jí)；②未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(imDCs)組和西羅莫司(SRL)組：移植皮片皮下組織有出血，腺體結(jié)構(gòu)不完整，但炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較對(duì)照組明顯減輕，分級(jí)為Ⅲ級(jí)；③聯(lián)合(imDCs+SRL)組：皮片各層結(jié)構(gòu)及皮膚附屬器形態(tài)完整，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，分級(jí)為Ⅱ級(jí)。聯(lián)合使用imDCs及SRL可降低移植物排斥反應(yīng)等級(jí)。

2.3 各組移植皮片生存時(shí)間(見(jiàn)表1):各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。control組8天左右移植皮片完全壞死脫落，imDCs組以及SRL組情況相似，7天左右皮膚出現(xiàn)局部潰瘍，10天左右移植皮片完全壞死，而imDCs+SRL組在7天時(shí)皮片成活較好，在2周左右皮片出現(xiàn)潰瘍，在3周左右移植皮片才形成干痂、壞死脫落。對(duì)照組與imDCs組、SRL組和imDCs+SRL組的移植皮片生存時(shí)間存在顯著差異（P＜0.05）；imDCs組與SRL組的移植皮片生存時(shí)間無(wú)顯著差異（P=0.74）；imDCs+SRL組與imDCs組、SRL組的移植皮片生存時(shí)間存在顯著差異（P＜0.05）。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明未成熟DC聯(lián)合應(yīng)用SRL可顯著延長(zhǎng)移植皮片的存活時(shí)間。

3討論

皮膚移植后的免疫排斥反應(yīng)是典型的細(xì)胞性排斥反應(yīng)，成熟DC表面表達(dá)豐富的MHC分子和輔助刺激因子，能有效地遞呈抗原并激活T細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答，而未成熟DC表面高表達(dá)MHC分子，低表達(dá)輔助刺激分子，缺乏啟動(dòng)T細(xì)胞應(yīng)答的功能。由于未成熟DC這一特點(diǎn)，在誘導(dǎo)免疫耐受、延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間中應(yīng)用[10]。目前已有動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，未成熟DC的輸注能在一定程度上延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間，但單獨(dú)應(yīng)用未成熟DC的效果尚不能令人滿意，主要由于未成熟DC由于表面缺乏協(xié)同刺激因子即T細(xì)胞活化的第二信號(hào)而引起T細(xì)胞特異性無(wú)應(yīng)答，但在攝取抗原后，或受到某些炎性細(xì)胞因子(如TNF-a)或某些細(xì)菌成分(如LPS)的刺激后，細(xì)胞表型迅速發(fā)生變化，表達(dá)高水平的協(xié)同刺激分子CD40和CD86，進(jìn)入成熟狀態(tài)，失去耐受原作用進(jìn)而誘發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng) [11-12]。因此，如何使DC穩(wěn)定地保持不成熟狀態(tài)是誘導(dǎo)免疫耐受的關(guān)鍵，而有關(guān)SRL的研究為解決這個(gè)難題提供了新的思路。

SRL為第三代免疫抑制劑，具有較強(qiáng)的抗移植排斥作用，且副作用明顯低于環(huán)孢素A，目前國(guó)內(nèi)外均已將SRL應(yīng)用于臨床器官移植術(shù)后患者。SRL的作用機(jī)制是通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)受體FK506結(jié)合蛋白12(FKBP12)結(jié)合，抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶哺乳動(dòng)物西羅莫司靶蛋白(mTOR)的功能，從而阻斷細(xì)胞因子受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，阻止淋巴細(xì)胞從G 期進(jìn)入S期，即抑制淋巴細(xì)胞在細(xì)胞因子誘導(dǎo)下的克隆增殖[13]。另一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)，此類藥物可抑制DC表面IL-18Rα和β的表達(dá)，從而減少I(mǎi)L-12的自分泌；同時(shí)通過(guò)阻斷Jak2/Stat4信號(hào)途徑阻止IL-12對(duì)自身IL-12R的激活，明顯抑制Dc的功能[14]。另外此類藥物還可以增加反應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)CD8+否決細(xì)胞的易感性，促進(jìn)后者引發(fā)的T細(xì)胞凋亡[15-16]。西羅莫司也在體外可部分改善創(chuàng)傷小鼠DC功能，并提高其誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答能力[17]。所以，如果能將未成熟DC與SRL結(jié)合起來(lái)，將有可能成為一種相對(duì)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的誘導(dǎo)免疫耐受的方案。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，與環(huán)孢素A及FK506常規(guī)免疫抑制劑相比，SRL與抗CD45RB、抗CD154等單克隆抗體具有更好的協(xié)同作用，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可明顯提高受者對(duì)移植物的接納率并易于誘導(dǎo)嵌合體形成[18-19]。但目前對(duì)于未成熟DC聯(lián)合SRL在誘導(dǎo)大鼠移植免疫耐受中的作用尚無(wú)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)我們選擇了大鼠皮膚移植模型，皮膚移植與心、腎等實(shí)質(zhì)器官移植相比，具有排斥反應(yīng)更強(qiáng)烈、誘導(dǎo)耐受更困難的特點(diǎn)。用供體未成熟DC預(yù)處理受者，1天后行異體皮膚移植術(shù)，在移植術(shù)后未應(yīng)用任何免疫抑制措施的前提下，移植皮膚存活時(shí)間延長(zhǎng)，說(shuō)明供體未成熟DC可在體內(nèi)誘導(dǎo)一定程度的免疫耐受。術(shù)后聯(lián)合使用SRL可使大鼠皮膚移植物的存活時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，說(shuō)明聯(lián)合使用SRL與未成熟DC在誘導(dǎo)大鼠皮膚移植免疫耐受中具有協(xié)同作用。我們認(rèn)為，在應(yīng)用供者未成熟DC作為耐受原誘導(dǎo)受者免疫耐受時(shí)，短期輔以SRL會(huì)使排斥反應(yīng)降低，移植物存活時(shí)間延長(zhǎng)。

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[收稿日期]2010-10-20 [修回日期]2010-01-07

編輯/張惠娟