I型IP3受體在自體中厚移植皮片中的表達(dá)

[摘要]目的：檢測I型1，4，5--三磷酸肌醇受體 (type I inositol 1，4，5-triphosphate receptor， IP3R1)在人自體中厚移植皮片中的表達(dá)，初步認(rèn)識(shí)由IP3受體介導(dǎo)的鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在自體中厚移植皮片過度色素沉著發(fā)生機(jī)制中的作用。方法：利用免疫組化SP方法，檢測IP3R1在自體移植中厚皮片、受區(qū)周圍與供區(qū)正常皮膚中的表達(dá)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：IP3R1的表達(dá)定位于表皮基底部黑素細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿，在大部分自體中厚移植皮片中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，與自體正常對照皮膚中的表達(dá)差異有顯著性意義(P<0.05)；IP3R1在受區(qū)周圍和供區(qū)正常對照皮膚中的表達(dá)差異無顯著性意義。結(jié)論：IP3R1在自體中厚移植皮片中的表達(dá)比自體正常對照皮膚中顯著提高，推測由IP3R1介導(dǎo)的胞內(nèi)鈣庫鈣離子釋放參與了鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在自體移植皮片過度色素沉著中的調(diào)控作用。

[關(guān)鍵詞]IP3受體；鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；自體移植皮片；過度色素沉著

[中圖分類號(hào)]R622 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2011）02-0229-03

Expression ofIP3R1in human split-thickness skin autografts

DAI Hai-ying，XUE Chun-yu，XING Xin，MEI Xiang，ZHANG Pei-pei，LI Ming

(Department of Plastic Surgery，Changhai Hospital，The Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of IP3R1 in human split-thickness skin autografts and to recognize the role of calcium signal transduction in hyperpigmented process of the skin autografts.MethodsImmunohistoehemieal technique was adopted to detect the expression of IP3R1 in the split-thickness grafted skin，the normal skin around the recipient area and normal skin separately and statistics was used to analyze the data.ResultsThe expression ofIP3R1 was located in endochylema of melanocytes and keratinocytes in the basilar part of epidermis. The expression ofIP3R1 in most of the split-thickness grafted skin was significantly higher than the control skin， The positive integral optical density ofIP3R1 in the split-thickness skin grafts (0.47±0.07) was significantly higher than that in the normal skin around the recipient site (0.21±0.09) and in the normal skin around the donor site (0.19±0.08).Showing statistically significant difference (P<0.05)．The expression ofIP3R1 in the normal skin of the donor area was no statistic remarkably differences compared to the normal skin around the recipient area． Conclusion The results indicate that the expression ofIP3R1 may markedly increase in the split-thickness grafted skin and correlate with its pigmentation affer the skin autograft．Calcium signal transduction may play an important role in hyperpigmented process of the skin autograft．

Key words:IP3R;calcium signal transduction;skin autograft;hyperpigmentation

自體皮片移植是整形外科中常用的手術(shù)方法，在修復(fù)各種原因(燒傷、外傷、腫瘤切除術(shù)后、畸形矯正)引起的組織缺損、矯治外形及改善功能等方面發(fā)揮著重要作用。但自體皮片移植后常伴有不同程度的過度色素沉著，影響外觀，限制了其臨床使用范圍，目前對于引起這一現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。有研究表明自體移植皮片中α-黑素細(xì)胞刺激素（α-melanocyte-stimulating hormone， α-MSH）的表達(dá)增加，激活其特異性黑皮素-1受體（melanocortin-1 receptor， MC-1R）而激發(fā)環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A通路使黑素細(xì)胞合成、分泌黑素增多是自體移植皮片過度色素沉著的重要因素[1-2]；而α-MSH前體的合成、酪氨酸酶的激活等都需要鈣信號(hào)的參與[3]，本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)在自體移植皮片中鈣調(diào)蛋白的表達(dá)量明顯增加。細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的產(chǎn)生有細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和胞內(nèi)鈣庫Ca2+釋放兩種途徑，而自體移植皮片中鈣信號(hào)的產(chǎn)生主要通過何種途徑介導(dǎo)目前還不清楚。因此本課題擬應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法SP法檢測三磷酸肌醇受體(type I inositol 1，4，5-triphosphate receptor，typeI IP3R)在自體中厚移植皮片中的表達(dá)，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在自體移植皮片過度色素沉著中的作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本：本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本均取自面頸部自體移植中厚皮片術(shù)后1年左右，因局部皮片攣縮或皮片過度色素沉著等因素需再次手術(shù)的我科患者。年齡10～35歲，男10例，女6例，均無垂體腎上腺疾病、傳染病、皮膚病及免疫性疾病，局部無感染、潰瘍，術(shù)前未應(yīng)用激素及免疫抑制劑治療，局部亦未曾行放射治療。將所取標(biāo)本按取材部位分為三組，實(shí)驗(yàn)組：受區(qū)移植皮片；對照組：受區(qū)周圍正常皮膚與供區(qū)周圍正常皮膚。標(biāo)本切取后在30min內(nèi)放入液氮瓶，12h內(nèi)移人-80℃冰箱中保存。

1.2 主要試劑：I型IP3受體抗體（Santa Cruz 公司，美國）；SP免疫組化染色試劑盒，DAB 試劑盒（Sigma 公司，美國)等。

1.3 免疫組化步驟：皮膚標(biāo)本經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋后。切成4mm石蠟切片，貼在涂有切片粘合劑的載玻片上。6O℃烤4～8h。將石蠟切片脫蠟至水，0.3%H2O2室溫20min，PBS洗3次，加入0.01mmol/L，pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液，微波處理2次(每次10min)，修復(fù)抗原，冷卻后PBS洗2次。加I型IP3受體抗體1:100稀釋，4℃孵育過夜，徹底水洗，加入1:200生物素化兔抗鼠IgG，室溫30min，加1:400 StrepAvidin-HRP，室溫30min。以上各步驟均經(jīng)0.01mmol/L PBS（pH7.4）沖洗3min，3次；然后將切片置0.05% DAB+0.03%H2O2顯色液中顯色8～12min；蒸餾水，沖洗，蘇木素復(fù)染1min；脫水，透明，中性樹膠封片。全部標(biāo)本用PBS做空白對照。

1.4 觀察與結(jié)果判定：按照呂宏升[4]等提出的免疫組化定量分析圖像采集方法要求，設(shè)定好參數(shù)，所有切片的照相工作均一次完成，采用專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0測得切片上DAB顯色為棕黃色代表陽性區(qū)域的光密度值，每張切片分別隨機(jī)選取10個(gè)視野，測量光密度，取其平均值作為平均光密度值，并將以此代表實(shí)驗(yàn)所研究蛋白的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)組與兩正常對照組的光密度值均以(x±s)表示。組間行配對t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

I型IP3受體主要位于黑素細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿，胞核亦有部分表達(dá)，呈黃色、棕黃色或棕褐色顆?；驁F(tuán)塊，呈局灶性或彌漫性分布，蘇木素復(fù)染胞核呈藍(lán)色，背景清晰。在大部分自體中厚移植皮片中呈強(qiáng)陽性表達(dá)。在表皮基底層處形成棕褐色條帶（圖1)。I型IP3受體在自體移植中厚皮片實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)的平均光密度值為0.47±0.07。在受區(qū)周圍正常對照皮膚對照組中表達(dá)的平均光密度值為0.21±0.09。在原供區(qū)周圍正常皮膚對照組中表達(dá)的平均光密度值為0.19±0.08。I型IP3受體在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)與在兩對照組正常對照皮膚中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在兩對照組間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

3討論

自體皮片移植是整形外科中常用的手術(shù)方法，但因皮片移植后常伴有不同程度的過度色素沉著而限制了其臨床應(yīng)用范圍，目前對于引起這一現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。有研究表明自體皮片移植過程中，多種因素的作用致皮片中α-MSH的表達(dá)增加，繼而激活其特異性受體MC-1R，使黑素細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的表達(dá)增加、活性增強(qiáng)，促進(jìn)黑素合成、分泌增加[5]，有研究亦表明α-MSH前體的合成[6]、酪氨酸酶的激活[7]等都需要鈣信號(hào)的參與。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)在自體移植皮片中鈣調(diào)蛋白的表達(dá)明顯增加，表明鈣信號(hào)傳導(dǎo)的增強(qiáng)參與調(diào)控了皮片過度色素沉著過程。而細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的產(chǎn)生有細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和胞內(nèi)鈣庫Ca2+釋放至細(xì)胞質(zhì)兩種途徑[8]，而胞內(nèi)鈣庫鈣離子釋放主要受IP3受體調(diào)控，故進(jìn)一步了解皮片中IP3受體的表達(dá)情況有助于理解皮片中鈣信號(hào)增強(qiáng)產(chǎn)生的途徑和機(jī)制。

IP3受體廣泛分布于各組織細(xì)胞，至少有3種亞型：IP3R1，IP3R2和IP3R3，這3種亞型的氨基酸序列具有60%～70%的同源性，其中I型IP3受體分布于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和外層核模[9-10]，釋放Ca2+能力最強(qiáng)[11]。IP3受體引起的Ca2+釋放具有以下幾個(gè)方面的特點(diǎn)：①雙相性：前期是快速釋放階段，隨之為慢速階段。前者的釋放速度與IP3的濃度成比例，而后者即使在恒定濃度的IP3下也非常緩慢；②雙激活劑：IP3受體通道的開放既受IP3的激活，也受Ca2+的激活。但Ca2+對通道開放的激活作用與Ca2+本身的濃度有關(guān)，在無IP3存在的情況下，低濃度(200～300 nmol/L)時(shí)通道激活，而高濃度抑制[12]；③負(fù)反饋：Taylor等[13]報(bào)道Ca2+與鈣調(diào)蛋白CaM結(jié)合可抑制IP3與受體結(jié)合，機(jī)制可能是CaM與IP3受體和Ca2+結(jié)合的部位相同，從而抑制IP3R通道的開放。IP3R通過以上幾種正反調(diào)控機(jī)制使胞內(nèi)鈣的濃度處于動(dòng)態(tài)平衡，維持細(xì)胞的正常生理狀態(tài)。

本組實(shí)驗(yàn)研究通過免疫組化方法觀察到自體移植皮片中IP3受體表達(dá)量明顯增加，在前期研究中亦發(fā)現(xiàn)皮片中鈣調(diào)蛋白的表達(dá)量明顯增加，說明皮片中鈣信號(hào)表達(dá)的增加與胞內(nèi)IP3受體激活后刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放鈣離子有關(guān)，推測存在某種因素抑制Ca2+與CaM對IP3受體的負(fù)反饋?zhàn)饔没蛘呤荌P3受體調(diào)控胞庫內(nèi)鈣釋放的閾值提高，使IP3受體表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)胞內(nèi)鈣離子的釋放，導(dǎo)致鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)，從而增加黑素細(xì)胞的黑色素合成與分泌，促進(jìn)自體移植皮片的色素沉著。

自體移植皮片中黑素細(xì)胞合成、分泌黑色素的功能增強(qiáng)，有許多因素參與調(diào)控，過程較為復(fù)雜。本研究結(jié)果顯示自體移植皮片黑素細(xì)胞中IP3受體激活后刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放，鈣信號(hào)發(fā)揮第二信使作用參與調(diào)控黑素細(xì)胞黑素合成、分泌過程，促進(jìn)自體移植皮片色素沉著。有研究顯示內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ、血管加壓素和白三烯[14]等可刺激細(xì)胞內(nèi)IP3水平增高促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，但在自體移植皮片過度色素沉著過程中，是何原因引起細(xì)胞內(nèi)IP3受體表達(dá)增高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)，在此過程中是否還存在細(xì)胞外鈣內(nèi)流的增加目前都還不清楚，需進(jìn)一步研究觀察。

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[收稿日期]2010-10-14 [修回日期]2010-01-13

編輯/張惠娟