不同配比納米羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯復(fù)合材料細(xì)胞相容性的研究

[摘要]目的：觀察不同配比nPCL/HA電紡纖維取向薄膜材料的細(xì)胞相容性。方法：將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）體外誘導(dǎo)培養(yǎng)為成骨細(xì)胞；并經(jīng)傳代培養(yǎng)第5代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以2×105cm2的密度與不同配比nPCL/HA電紡纖維取向薄膜支架在培養(yǎng)板內(nèi)共培養(yǎng)，同時(shí)以nPCL電紡纖維非取向薄膜材料作為對照，初步觀察hBMSCs在不同配比nPCL/HA支架材料上復(fù)合培養(yǎng)，對其細(xì)胞相容性進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果：hBMSCs與3種電紡薄膜支架材料均有細(xì)胞相容性，細(xì)胞能在不同材料表面黏附生長、分化增殖。但是PCL/ HA的配比為20:1電紡纖維取向薄膜材料黏附率（35.3±2.6）%，為3中材料中黏附率最高的一種，材料表面細(xì)胞生長良好，體積變大，有偽足生長。結(jié)論：PCL/ HA的配比為20：1電紡纖維取向薄膜材料，較適合作為支架材料應(yīng)用于hBMSCs為種子細(xì)胞的組織工程構(gòu)建。

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；聚己內(nèi)酯；羥基磷灰石；細(xì)胞相容性

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2011）02-0243-04

Cellular biocompatibility of various electrospunnPCL/HA scaffold materials

LI Jia-feng1，WAN Mei-rong2，GUAN Hai-hong1，HE Wen-peng1，ZHANG Hong-chuang1，ZHANG Yang1，CHEN Li-juan1

(1.Department of Oral Maxillofacial Surgery， Affiliated Xuzhou City Hospital of Xuzhou Medical College; 2.Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002，Jiangsu，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate cellular biocompatibilityof different nPCL/HA scaffold materials.MethodsElectrostatic spinning or electrospinning is an interesting method for producing nonwoven fibers with diameters of submicrometers down to nanometers. Nanofibrous membranes were used in many biomedical applications including drug delivery， wound healing and scaffolding for tissue engineering. Novel bone-scaffolding materials were successfully fabricated by electrospinning from polycaprolactone(PCL) solutions containing nanoparticles of hydroxyapatite(HA). In intro cultured hBMSCs(5th generation) were seeded at the density of 2×105 cell/cm2 onto scaffolds ofnPCL/HA and nPCL as control. The cell-material complex was observed in order to evaluate the cellular biocompatibilitybetween cells and materials.ResultsHBMSCs were shown good adhesion to all 3 types of scaffolds after seeding. The cellular biocompatibilityof nPCL/HA(20:1) (35.3±2.6)% washigher than the others.ConclusionNano-PCL/HA(20:1) was shown significantly higher adhesion rate to hBMSCs， and could be used as scaffold material in the field of bone tissue engineering.

Key words:bone marrow stromal cells; polycaprolactone; hydroxypatite; cellular biocompatibility

納米羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯復(fù)合材料是由豬骨提取的羥基磷灰石和聚己內(nèi)酯交聯(lián)法獲得的。羥基磷灰石是骨組織的成分，納米級羥基磷灰石（Nano-HA）除了具有傳統(tǒng)HA的特性外，在理化性質(zhì)和生物學(xué)方面有更大的優(yōu)點(diǎn)[1-2]。聚己內(nèi)酯（PCL）是一種被廣泛研究的可生物降解高分子材料，具有良好的生物相容性，且藥物通透性好。目前已在很多領(lǐng)域得到應(yīng)用，尤其是在醫(yī)療方面，如膠帶、繃帶、矯正器、縫合線、藥物緩釋劑以及組織工程支架材料等。作為一種新復(fù)合材料，我們對其生物相容性進(jìn)行評定，本文主要是評價(jià)該復(fù)合材料在體外的細(xì)胞相容性。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和材料 試劑：MSCM（SCICELL），低糖DMEM/ F12（Hgclone，USA），胎牛血清（杭州四季清），淋巴細(xì)胞分離液（上海，比重為1.073g/ml），堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF(promege)，人表皮生長因子EGF(promege)，RT-PCR試劑盒（北京天根生物有限公司），倒置顯微鏡（日本），二氧化碳培養(yǎng)箱，離心機(jī)。nPCL/HA電紡納米纖維（東南大學(xué)生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：本文所用材料nPCL/HA電紡取向薄膜由由東南大學(xué)生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，共有3種，分別是：1號樣品含HA比例為PCL:HA是5:1、2號樣品含HA比例為10:1、3號樣品含HA比例為20:1的乙酸乙酯溶液的電紡取向薄膜；4號樣品為一種不含HA的PCL的乙酸乙酯溶液的電紡纖維非取向薄膜作為對照。納米電紡薄膜的直徑約為1～5μm，材料規(guī)格約10cm×6cm大小，環(huán)氧乙烷消毒后備用。使用時(shí)制備成5mm×5mm。

1.2.2 人BMSCs的分離與培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)所用肝素化的骨髓，來源于研究人員自身骨髓。20ml骨髓血與等量PBS混合，1500rpm、離心10min，棄脂肪和上清層。用PBS重懸細(xì)胞，以3:1體積比加入Percoll(1.073g/ml)液面上，3 000rpm、離心25min。取單個(gè)核細(xì)胞層，用PBS洗遍2次，第三遍用含10%胎牛血清的DMEM/F12洗，接種于MSCM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2箱常規(guī)培養(yǎng)。72h后更換新鮮培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每隔3天更換一次培養(yǎng)液。形成多個(gè)細(xì)胞克隆，傳代培養(yǎng)，傳至第5代(P5)細(xì)胞待用。

1.2.3hMSCs向成骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo) ：取P5代的MSCs，再更換為誘導(dǎo)液：用含10-7mol/L地塞米松 10-2mol/Lβ-甘油酸鈉500μg/L的維生素C的培養(yǎng)液來培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.4流式細(xì)胞儀：分別取誘導(dǎo)前P5代細(xì)胞和誘導(dǎo)后72h的細(xì)胞，0.25%胰酶消化后收集細(xì)胞，分別加入FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD34、CD45抗體，常溫暗室孵育20min，加入PBS 2ml，2 500r/min離心5min，棄上清，加入PBS 500μl混勻后用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5RT-PCR：分別取誘導(dǎo)前P5代細(xì)胞和誘導(dǎo)后72h的細(xì)胞，0.25%胰酶消化后收集細(xì)胞，做RT-PCR，以高純度離心柱試劑盒提取總RNA。PCR反應(yīng)體系為25ul體系，40個(gè)循環(huán)。引物序列分別為：Ⅰ型膠原蛋白(534bp)：上游5＇-GGTTTGGAGAGAGCATGACC-3＇，下游5＇-TTTGGGGAAATTGA GTTTGG-3＇。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.2.7復(fù)合材料復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)和粘附實(shí)驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)將nPCL/HA納米電紡取向薄膜制備成5mm×5mm大小，環(huán)氧乙烷消毒后置于24孔培養(yǎng)板，將傳至第5代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以2×105/cm2的密度接種于材料上，靜態(tài)2h后再加1ml培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)24h、48h、72h，用倒置顯微鏡（40×100倍）觀察細(xì)胞生長及黏附情況。黏附率的測定采用間接計(jì)數(shù)法計(jì)算，具體方法為：將材料取出，用胰酶消化細(xì)胞，胎牛血清終止反應(yīng)，PBS輕輕沖洗，收集細(xì)胞；另行將培養(yǎng)板殘余細(xì)胞消化收集，分別計(jì)數(shù)，所得結(jié)果為未黏附細(xì)胞數(shù)。材料的細(xì)胞黏附率=（總細(xì)胞數(shù)－未黏附細(xì)胞數(shù)）/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下觀察：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離接種24h后細(xì)胞呈半貼壁狀態(tài)，扁平（圖1A），48h后完全貼壁，有“出芽現(xiàn)象”（圖1B），72h后細(xì)胞呈紡鍾狀，有偽足生長，加入新鮮培養(yǎng)基后，細(xì)胞逐漸形成梭形。7天后細(xì)胞逐漸形成集落（圖1C），由15～20個(gè)細(xì)胞融合成，細(xì)胞排列有一定的方向性，呈漩渦狀排列，象成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)14天細(xì)胞融合80%～100%傳代擴(kuò)增，24h細(xì)胞完全貼壁，此時(shí)細(xì)胞增殖較旺盛，每周擴(kuò)增一次，共計(jì)五次。加入誘導(dǎo)劑培養(yǎng)72h后細(xì)胞細(xì)胞由單一的纖維狀變成立方形三角形多邊形，體積增大，細(xì)胞表面分泌出顆粒狀物質(zhì)，增殖細(xì)胞之間界限模糊，局部細(xì)胞可呈復(fù)層生長，與成骨細(xì)胞有相似的形態(tài)和生長特點(diǎn)，最終形成骨結(jié)節(jié)（圖1D）。

2.2nPCL/HA材料的掃描電鏡檢測細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察：（見圖2）；纖維薄膜呈取向性。

2.3 HBMSCs在材料表面生長分化：HBMSCs接種培養(yǎng)于不同配比的電紡薄膜表面后，采用倒置顯微鏡（40×100倍）下觀察細(xì)胞在電紡薄膜表面的黏附情況，并據(jù)此測算其黏附率。培養(yǎng)24h后，可見不同材料表面黏附細(xì)胞數(shù)量不一，細(xì)胞形態(tài)不一。48h后，見不同材料人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞緊貼薄膜表面，細(xì)胞開始變形，大小形態(tài)不一，交錯(cuò)明顯，細(xì)胞無偽足生長。72h后，3號材料細(xì)胞黏附，大小不一，部分細(xì)胞偽足生長不明顯，部分細(xì)胞偽足生長明顯，有個(gè)別細(xì)胞未有偽足生長（圖3A）。2號材料MSCs細(xì)胞黏附，未見有明顯偽足伸展，大小不一。有個(gè)別孔隙內(nèi)細(xì)胞黏附，偽足伸展（圖3B）。1號材料MSCs細(xì)胞生長分布均勻，黏附表面，細(xì)胞有偽足生長明顯。見細(xì)胞形態(tài)不一（圖3C）。

2.4 3種不同材料的黏附率分別為：28.8%±2.5%，24.8%±2.3%，35.3%±2.6%，對照材料49.9%±2.3%。表1中可見，在3號電紡纖維取向薄膜材料的黏附率最高，且與nPCL電紡纖維非取向薄膜材料的黏附率相近，2號電紡纖維取向薄膜材料的黏附率最低。

2.4 RT-PCR結(jié)果：圖像分析結(jié)果表明，MSCs的I型膠原mRNA的表達(dá)很弱，細(xì)胞定向誘導(dǎo)后，I型膠原mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)，如圖4。

2.5流式細(xì)胞儀：hMSCs表型鑒定結(jié)果:P1骨髓干細(xì)胞CD34、CD45熒光強(qiáng)度為9.97和16.10；P5 CD34、CD45熒光強(qiáng)度分別為144.79和237.55 (圖5)。

3討論

細(xì)胞培養(yǎng)法檢測材料細(xì)胞相容性是一種快速、簡便、有效廉價(jià)的方法，在材料生物相容性評價(jià)中有至關(guān)重要的作用。復(fù)合材料與細(xì)胞在體外培養(yǎng)可以消除體內(nèi)多種因素的干擾，直接觀察細(xì)胞在材料表面的粘附、生長和分化增殖情況。研究認(rèn)為不同組織來源的細(xì)胞對材料的敏感度是有差異的[3]。我們用以實(shí)驗(yàn)的組織工程材料是骨組織修復(fù)材料，因此需選用骨髓來源地細(xì)胞或者具備能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為骨的細(xì)胞作為種子細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向轉(zhuǎn)化的潛能，通過生長因子的誘導(dǎo)，最終能分化為成骨細(xì)胞，在骨缺損的修復(fù)過程中起著重要作用，是當(dāng)前最適骨組織工程的種子細(xì)胞[4]。MSCs在骨髓中的含量并不高，我們通過流式細(xì)胞儀檢測CD34、CD45的表達(dá)很低，經(jīng)過梯度離心和貼壁培養(yǎng)，P1熒光強(qiáng)度分別為9.97和16.10，經(jīng)傳代、純化CD34、CD45的表達(dá)明顯升高，P5熒光強(qiáng)度分別為144.79和237.55，說明在較短時(shí)間內(nèi)可以獲得大量種子細(xì)胞。另外，分泌Ⅰ型膠原是骨細(xì)胞的特征之一，用RT-PCR方法可檢測誘導(dǎo)后72h的Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)比誘導(dǎo)前明顯升高，從分子水平上說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以向成骨細(xì)胞分化。研究表明細(xì)胞在材料表面的粘附有多種因素，其中主要有材料表面的粗糙程度、表面修飾、改性和材料的方向性等[5]。Baier等人認(rèn)為材料表面的特性和自由能決定細(xì)胞的生物你粘附性，動物實(shí)驗(yàn)表明低表面能材料粘附的細(xì)胞呈球形或者橢圓形，粘附作用極弱；高表面能材料被細(xì)胞覆蓋，粘附的細(xì)胞呈扁平，有偽足生長且伸長的形態(tài)，粘附作用較強(qiáng)。結(jié)果表明高表面能材料表面更有利于細(xì)胞粘附生長。另外，合成生物材料表面的理化結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞的粘附和生長起到重要作用。研究認(rèn)為[6-7]，材料表面結(jié)構(gòu)不同有不同的生物特性，比如羥基、酰胺基等，有利于細(xì)胞的生長粘附。

在本研究中，nPCL/HA電紡薄膜復(fù)合材料直徑約為1～5μm，同時(shí)以單純納米級PCL非取向電紡纖維薄膜材料作為實(shí)驗(yàn)對照，組織工程支架材料加入納米級羥基磷灰石晶體顆粒，通過選擇適當(dāng)加工參數(shù)，能夠調(diào)控支架材料的孔隙率、厚度、三維結(jié)構(gòu)（縱橫交錯(cuò)或者有取向性）、降解率和動力學(xué)性能等。聚己內(nèi)酯（PCL）是通過己內(nèi)酯的開環(huán)聚合得到的屬于人工合成的脂肪族聚酯，是一種半結(jié)晶型聚合物，其結(jié)構(gòu)重復(fù)單元上有5個(gè)非極性亞甲基和一個(gè)極性酯基，使得其具有很好的柔韌性和加工性，同時(shí)具有很好的生物相容性[8-9]。該研究中三種實(shí)驗(yàn)材料，聚己內(nèi)酯與羥基磷灰石的配比不同，分別為5:1、10:1、20:1，這樣材料的表面結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，表面能是不同的，研究通過與細(xì)胞的粘附，證明何種配比的材料能達(dá)到最佳的生長粘附、增殖分化。本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞與材料復(fù)合培養(yǎng)24h后，可見不同材料表面黏附細(xì)胞數(shù)量不一，細(xì)胞形態(tài)不一。48h后，見不同材料人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞緊貼薄膜表面，細(xì)胞開始變形，大小形態(tài)不一，交錯(cuò)明顯，細(xì)胞無偽足生長。72h后，材料之間細(xì)胞粘附的差異開始明顯，有的材料細(xì)胞黏附形態(tài)大小不一，細(xì)胞偽足生長不明顯；有的細(xì)胞偽足生長明顯，有個(gè)別細(xì)胞未有偽足生長，個(gè)別孔隙內(nèi)細(xì)胞黏附數(shù)量較多。說明細(xì)胞在材料表面生長、粘附、分化與其表面結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。復(fù)合支架材料保持很高的孔徑和孔隙率，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，材料中的納米HA與骨組織中的羥基磷灰石類似。我們實(shí)驗(yàn)中的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）是我們研究人員志愿者捐獻(xiàn)，通過分離傳代培養(yǎng)獲得的經(jīng)檢測證實(shí)細(xì)胞純度高、性能穩(wěn)定、增殖能力強(qiáng)。倒置顯微鏡觀察，hBMSCs不僅可以在材料表面黏附，而且纖維愈細(xì)，孔隙率愈高，生長黏附愈好，與文獻(xiàn)中報(bào)告相一致。本研究觀察到細(xì)胞黏附與纖維的方向性（取向性）一致，即無取向電紡纖維薄膜上細(xì)胞呈雜亂生長，而取向電紡纖維薄膜上細(xì)胞呈取向性生長，也就是說取向性誘導(dǎo)了細(xì)胞的取向生長，并且能夠短時(shí)間內(nèi)變大，伸展，有偽足生長并向周圍鋪展。以往研究僅表明nPCL電紡纖維薄膜上細(xì)胞的相容性好，細(xì)胞能較好的黏附、生長和繁殖，而本研究結(jié)果表明，不同配比的nPCL/HA電紡纖維取向薄膜也是一種較好的骨組織工程支架材料，適合應(yīng)用于hBMSCs作為種子細(xì)胞的組織構(gòu)建，尤其3號電紡纖維取向薄膜材料的黏附率與單純nPCL電紡纖維非取向薄膜的黏附率最接近。通常來說，表面粗糙的材料，細(xì)胞黏附能力優(yōu)于表面光滑材料[10]。nPCL/HA大體外觀光滑均勻，纖維直徑1～5μm，與細(xì)胞外基質(zhì)天然結(jié)構(gòu)相似，同時(shí)纖維支架材料中引入的不同比率HA納米粒子，對材料進(jìn)行改性，使其表面積大，纖維均一，孔隙率高，有利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)、細(xì)胞的黏附、生長和分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)表明：3種材料表面的細(xì)胞黏附率有較差異性，材料的配比不同，纖維粗細(xì)不同，所取得材料物化性質(zhì)和表面結(jié)構(gòu)存在差異，細(xì)胞所需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)穿透纖維薄膜通過率不同，從而使得細(xì)胞黏附率不同。

本實(shí)驗(yàn)表明，3號電紡取向薄膜，具有較高的孔隙率、良好的物化性質(zhì)和細(xì)胞相容性，有利于種子細(xì)胞黏附生長，比另外兩種材料更適合骨組織工程構(gòu)建。

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[收稿日期]2010-10-22 [修回日期]2011-01-11

編輯/張惠娟