特異引物PCR快速檢測可疑牙周致病菌的相關(guān)性研究

[摘要]目的：尋求快速檢測伴放線放線桿菌（Aa）、牙齦卟啉菌（Pg）和中間普氏菌（Pi）在牙周感染患者人群中感染率的方法。方法：特異引物PCR，檢測3種牙周可疑致病菌在30例中重度牙周病及30名正常組齦溝液中的定植情況。結(jié)果：PCR方法檢出細(xì)菌的最低檢測量為3.25ng。Pg在中重度牙周病檢出率86.7%，高于正常組13.3%，P＜0.001。Pi在中重度牙周病檢出率為70%正常組為20%，P＜0.001。伴放線放線桿菌在中重度牙周炎Aa檢出率為6.7%，正常組檢出率為3.3%，P＞0.5。結(jié)論：PCR方法是特異性強(qiáng)，敏感性高的有效方法。Pg是成人牙周炎可疑致病菌。Pi是成人牙周炎可疑致病菌。Aa可能是牙周正常菌群一部分，需要大樣本進(jìn)一步檢測。

[關(guān)鍵詞]牙周可疑致病菌；牙周病；PCR

[中圖分類號]R783 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）02-0279-03

Study on the specific-primer PCR detection of 3 species of putative periodontal pathogens and the correlation between the presence of bacteria and periodontosis

LI Da-xu1，LI Xiao-hong1，REN Le2，CHANG Xiao-feng1

(1.Department of Oral Impiant，Affiliated Stomatology hospiton ofXi'an JiaotongUniversity，Xi'an 710003，Shaanxi，China;2.Department of Stomatology，The First Affillated Hosptial of collegeof Xi'an Jiaotong University)

Abstract:Objective To establish a rapid multiple specific-primer PCR for detection of three species of bacteria Aa，Pi and Pg，and the correlation between the presence of bacteria and the periodontosis.Methods Subgingival microflora samples were collected from 30 patients with moderate to sever periodotitis and 30 periodontally healthy patients，the PCR was used to amplify the target genes.ResultsSensitivity and specificity of PCR were also evaluated with the reference bacteria. The multiplePCR was able to detect a minimum of 3.25ng bacteria DNA.With good specificity，target fragments of 3 species of bacteria were detected.The prevalence of Pg in adults periodentosis were 86.7% vs 13.3% in the healthy group(P＜0.001). The prevalence of Pi in adults periodentosis were 70% vs 20% in the healthy group (P＜0.001 )，The prevalence of Aa in adults periodentosis were 6.7% vs 3.3% in the healthy group (P＞0.5).Conclusion As the putative periodontal pathogens of adult periodontitis，Pg，Pi，Aamay be part of the normal oral flora，that need futher study.

Key words:putative periodontal pathogens;adult periodotitis;PCR

細(xì)菌是牙周病的始動因子，但究竟哪些細(xì)菌與牙周病直接相關(guān)目前還沒有確切的結(jié)論。細(xì)菌和牙周病臨床表現(xiàn)的復(fù)雜性及各個(gè)實(shí)驗(yàn)室方法上的差異都可能導(dǎo)致主要可疑牙周致病菌檢出上的差異，目前國外研究檢出比較多的有牙齦卟啉菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)、中間普氏菌(Prevot ellaintermedia，Pi)、伴放線放線桿菌（A.actinomycetemco mitans，Aa）等。建立快速的檢測方法研究細(xì)菌與牙周病的關(guān)系及作為牙周病預(yù)防和治療監(jiān)測的手段有非常重要的實(shí)際意義[1]。本研究旨在探討應(yīng)用PCR方法建立牙周可疑致病菌快速檢測方法，并檢驗(yàn)可疑致病菌與牙周病的相關(guān)性。

1材料和方法

1.1病例選擇

1.1.1牙周病組：選擇 30例成人慢性牙周炎（ACP）患者，年齡28～65歲，全身無系統(tǒng)性疾病，半年內(nèi)未做過牙周治療，3個(gè)月內(nèi)未服用過抗生素，根據(jù)常規(guī)Hugoson法對上述病例進(jìn)行分類，Hugoson法分為輕、中、重3類：①輕度：牙周袋深度≤4mm，附著喪失≤2mm，牙槽骨吸收為牙根長度≤1/3，無牙松動；②中度：4mm＜牙周袋深度≤6mm，附著喪失3～5mm，牙槽骨吸收為牙根長度≤1/2，輕度牙松動；③重度：牙周袋深度＞6mm，牙槽骨吸收為牙根長度＞1/2，牙松動明顯。30例均為中重度牙周病。

1.1.2健康對照組：選擇30例健康人群，牙周探診深度＜3mm，牙齦出血指數(shù)(-)，菌斑指數(shù)＜2°，牙齦無紅腫，半年內(nèi)未做過牙周治療，3個(gè)月內(nèi)沒有服用過抗生素。

1.2實(shí)驗(yàn)菌株： PgATCC 332777 由首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。伴放線放線桿菌 Aa ATCC 29522，中間普氏菌Pi ATCC2561由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院提供。

1.3齦下細(xì)菌樣本采集方法：①牙周病組：先用齦上潔治器祛除齦上菌斑，然后用棉球搽干、隔濕、氣槍吹干。牙周病組選擇牙周袋最深處取樣，用30號紙尖直接插入牙周袋袋底，靜置30s，紙尖立即置于1.5mlEP管中，PBS緩沖液200ul，-20℃凍存，待用；②健康對照組：棉球搽干、隔濕、氣槍吹干。用3個(gè)30號紙尖分別位于第一磨牙的近頰、頰側(cè)和遠(yuǎn)頰，插入牙周袋袋底，靜置30s，紙尖立即置于1.5mlEP管中，PBS緩沖液200ul，-20℃凍存，待用。

1.4模板DNA提?。喝〕鳊l下細(xì)菌樣本，4℃解凍5000r、10min；去上清，加入裂解液（1mmol/LEDTA、1% Triton X-100、10mmol/L This-Hcl PH 8.0）20ul充分震蕩后，99°C (PCR儀9700型，ABI公司，美國)10min，12 000r 2min，取上清作PCR模板。

1.5 Pg 反應(yīng)體系：終濃度 1.4 unitsTaq polymerase，280μM dNTP，1.7mM MgCL2，400nM上游引物和下游引物，11.2mM Tris-HCL;56mM KCL。

1.6 Pi Aa反應(yīng)體系：終濃度 1.4 unitsTaq polymerase，280μM dNTP，1.7mM MgCl2，400nm上游引物和下游引物，11.2 mM Tris-HCL，56mM KCL。

1.7反應(yīng)條件（見表3）

1.8多重PCR體系確定（見表4）

1.9 PCR敏感實(shí)驗(yàn)：測試原菌液裂解后260～280nm分光光度儀測定DNA濃度約634μg/ml，DNA倍比稀釋依次為1、10、102、103、104、105～109均不可見DNA擴(kuò)增條帶。104的稀釋濃度為0.65μg/ml，PCR樣本量為5μl，經(jīng)計(jì)算后所的結(jié)果最低檢測量為3.25ng（如圖1）。

3討論

牙周病分為活動期及靜止期，交替發(fā)展，對于牙周細(xì)菌變化的早期鑒定和檢測對于牙周病的預(yù)防在產(chǎn)生骨質(zhì)破壞之前有著極其重要的意義，本文所建立的PCR方法敏感度高，所檢測最低DNA量為3.25ng，檢測敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法。Slots[2]報(bào)道齦下菌斑Pg陽性率細(xì)菌培養(yǎng)法為34.5%，直接PCR法為63.4%。Jervce-Storm P-M[3]等對22例中重度牙周炎患者的78例齦下菌群樣本Pi進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)通過傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)方法和PCR方法的檢出率分別為33%和94%，傳統(tǒng)方法與PCR檢出率存在顯著差異，可見PCR方法優(yōu)于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)學(xué)方法。PCR應(yīng)用與口腔細(xì)菌檢測是一種可靠、穩(wěn)定，敏感性極高的方法。本實(shí)驗(yàn)牙周炎組齦下菌斑的Pg陽性率為86.7%，明顯高于牙周健康13.3%，P＜0.001，與很多研究者的結(jié)果相同。Haffajee[4]對90例牙周炎患者的2 299個(gè)位點(diǎn)用NDA探針檢測出Pg的陽性率為91%。Soder[5]對20例重度牙周炎的198個(gè)病變位點(diǎn)用DNA探針了解牙周病原菌的檢出率，Pg為95%，與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相同，故進(jìn)一步印證了Pg與牙周病的相關(guān)性。

Aa的研究較多爭議性較大。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示中重度牙周病組的Aa檢出率為6.7%，正常組Aa的檢出率為3.3%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Mobelli[6]和Tanks[7]對中國人重度牙周炎患者及健康人的研究發(fā)現(xiàn)Aa的檢出率分別為63%和78%，健康者與患者無明顯差別，認(rèn)為Aa可能是中國人正常菌群的組成部分。根據(jù)Moore WEC HL[8]的報(bào)道，在牙周病患者的Aa檢出率為6%，是正常人1.4%的6倍，Asikainen S等亦得到相同的結(jié)果[9]，Aa對于牙周病的相關(guān)性應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行討論和驗(yàn)證。

牙周病組Pi檢出率為70%，正常組檢出率為20%，P＜0.001，中間普氏菌被認(rèn)為是牙周可疑致病菌與牙周健康存在密切關(guān)系。 賈曉真[10]等采用厭氧培養(yǎng)和鑒定技術(shù)在受檢的33例牙周炎患者中，18例患者檢出了中間普氏菌，總檢出率為54.54%。并且報(bào)道中間普氏菌與牙周炎中度相關(guān)，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。

PCR方法是特異性強(qiáng)，敏感性高的有效方法。Pg是成人牙周炎可疑致病菌，Pi是成人牙周炎可疑致病菌，Aa可能是牙周正常菌群一部分，需要大樣本進(jìn)一步檢測。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Zambon JJ，HaraszthyⅥ.The laboratory diagnosis of periodontal infections[J].Periodontology，2000，7:69-82.

[2]Slots J，Ashimoto A，F(xiàn)lynn MJ，et al.Detection of putative periodontal pathogens in subgingival specimens by 16 Sribosomal DNA amplification with the polymerase chain reaction[J].Clin Infect Dis，1995，20(Suppl2):S304.

[3]Jervce-Storm P-M KM，F(xiàn)alk W，Doorfer A，et al.comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periodontopathogenic bacteria in subgingival plaque samples[J].J Clin Periodontol，2005，32:778-783.

[4]Haffajee AD，Socransky SS，Smith C，et al.The use of DNA probes to examine the distribution of subgingival species in subiects with different levels of periodontal destruction[J].J Clin Periodontol，1992，19:84.

[5]Soder PO，Soder B.DNA probe detection of periodontopathogens in advanced periodontitis[J].Scand J Dent Res， 1993，101:363.

[6]Mombelli A GR，Lang NP.Actinobacillus actinomycetemcomitans in Chinese adults.Serotype distribution and analysis of the leukotoxin gene promoter locus[J].J Clin Periodontol，1999，26:505-510.

[7]Tan KS，Woo CH，Ong G，et al.Prevalence of Actinobacillus actinomycetemcomitans in an ethnic adult Chinese population[J].J Clin Periodontol，2001，28(9):886-90.

[8]Moore WEC HL，Cato EP，Smibert RM，et al.Comparative microbiology of juvenile periodontitis[J].Infect Immun 1985，48:507-519.

[9]Asikainen S J-SH，Kanervo A，Summanen P.Certain bacterial species and morphotypes in localized juvenile periodontitis and in matched controls[J].J Peri Odontol，1987，58:224-230.

[10]賈曉真，樊明文，李成章.牙齦卟啉菌、中間普氏菌的分離、培養(yǎng)和鑒定[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2002，12（9）：940-941.

[收稿日期]2011-01-05 [修回日期]2011-02-11

編輯/何志斌