6-O-羧甲基殼聚糖對人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的影響

[摘要]目的：觀察不同濃度6-O-羧甲基殼聚糖（6-O-CMC）對體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（hypertrophic scar fibrob lasts，HSFBs ）轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (transforming growth factor-beta1，TGF-β1) 蛋白及mRNA表達(dá)的影響，在分子水平上探討其抑制增生性瘢痕生長的作用機(jī)制。 方法：體外培養(yǎng)人HSFBs，選取第3～5代細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組采用含不同濃度6-O-CMC（0，100，200，400μg/ml）的DMEM培養(yǎng)液分別進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，顯微鏡下觀察各組HSFBs形態(tài)及生長情況。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，運(yùn)用雙抗體夾心ELISA法檢測各組TGF-β1蛋白表達(dá)水平。運(yùn)用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測各組TGF-β1 mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：與空白組相比，三個藥物劑量組HSFBs TGF-β1蛋白及mRNA的表達(dá)均減少（P<0.05），藥物濃度越高表達(dá)量越低（P<0.05），且TGF-β1 蛋白及mRNA表達(dá)的變化具有一致性。 結(jié)論：6-O-CMC有抑制體外培養(yǎng)的人HSFBs TGF-β1表達(dá)的作用，初步探討了6-O-CMC發(fā)揮抑制增生性瘢痕生長的作用機(jī)制，為羧甲基殼聚糖類藥物的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]6-O-羧甲基殼聚糖；增生性瘢痕成纖維細(xì)胞；TGF-β1；ELISA；熒光定量RT-PCR

[中圖分類號]R619+.6[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）02-0240-03

Effects of 6-O-carboxymethyl-chitosan on the expression of TGF-β1 in human hypertrophic scar fibroblasts

WU Dan1，KUANG Rui-xia2，WANG Zhi-guo2，CHEN Lu2，ZHOU Ming1，HUANG Hong-jie1

(1.Medical College of Qingdao University，Qingdao 266021，Shandong，China； 2.Department of Plastic Surgery，The Affiliated Hospital of Medical College Qingdao University，Qingdao 266013，Shandong， China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of 6-O-carboxymethyl-chitosan (6-O-CMC) with different concentrations on the expression of transforming growth factor-beta1 (TGF-β1) in human hypertrophic scar fibroblasts (HSFBs) in vitro.MethodsHSFBs were cultured in vitro，and the 3～5 generation cells were chose to the next experiment. The DMEM medium with different concentrations of 6-O-CMC (100，200，400ug/ml) were used in the experimental groups， and the control group without 6-O-CMC. After 24 hours， cell morphology and growth state of HSFBs were observed under the microscope. The expression of TGF-β1 protein was detected by ELISA. The expression of TGF-β1 mRNA was was detected by Real-time RT-PCR. ResultsCompared with the control group， the expressions of HSFBs TGF-β1 protein and mRNA in the other groups all reduced obviously (P<0.05). Concentration and expression were in inverse proportion(P<0.05). The expression of TGF-β1 protein and mRNA are on the same direction.Conclusions6-O-CMC could suppress the expression of HSFBs TGF-β1.We exploring the mechanism of 6-O-CMC in treating hypertrophic scar，which provides theoretical basis for the development and utilization of new drugs.

Key words:6-O-carboxymethyl-chitosan；hypertrophic scar fibroblasts；TGF-β1；ELISA；Real-time RT-PCR

增生性瘢痕(hypertrophic scar， HS)的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。組織學(xué)上以皮膚創(chuàng)傷愈合過程中成纖維細(xì)胞異常增生及大量的膠原合成沉積為特征。在HS病理過程中，TGF-β1被認(rèn)為起著關(guān)鍵性的作用，它不僅可以加速成纖維細(xì)胞的增殖，還可促進(jìn)膠原的蛋白合成[1-2]。因此，拮抗TGF-β1作用或減少其表達(dá)的藥物可能對HS有治療作用。有研究表明，羧甲基殼多糖對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩及增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成有明顯的抑制作用[3-4]，但其通過那些因子如何發(fā)揮作用尚需深入研究。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同濃度6-O-CMC對TGF-β1蛋白及 mRNA表達(dá)水平的影響，在分子水平上探討其抑制HS形成的作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1 主要材料和儀器：6-O-CMC粉末（中國海洋大學(xué)惠贈）； DMEM（美國Gibco公司）；胎牛血清（北京華美生物制劑公司）； ELASE試劑盒（RD）；Thizol試劑盒（美國Invitrogen公司）；SYBR Premix Script 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司）；7500型熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad 公司)；醫(yī)用凈化工作臺；CO2培養(yǎng)箱 ；倒置相差顯微鏡。

1.2 標(biāo)本來源：標(biāo)本為HS組織塊10塊，分別來自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院整形外科的10例患者。選擇標(biāo)準(zhǔn)：HS患者10例，男5例，女5例，年齡12～40歲，病程10～18個月。所有瘢痕均呈紅色，質(zhì)硬， 高出周圍正常皮膚1cm以上，患者均有瘢痕區(qū)瘙癢或疼痛等不適。瘢痕處于增生活躍期。患者無結(jié)締組織疾病或可能影響結(jié)締組織代謝的其他疾??；無心、肺、肝、腎等慢性疾?。?個月內(nèi)未使用類固醇激素類藥物、抗腫瘤藥物等，且未曾接受放療。

1.3HSFBs的原代及傳代培養(yǎng)：稱取手術(shù)切除的增生性瘢痕組織塊約5g，去除表皮及皮下脂肪，在無菌條件下漂洗、消毒，留白色質(zhì)韌真皮膠原組織備用。原代培養(yǎng)采用組織塊培養(yǎng)法，具體方法參照文獻(xiàn)[5-6]進(jìn)行，待細(xì)胞融合至80%時，常規(guī)消化、傳代。實(shí)驗(yàn)選用第3～5代細(xì)胞。

1.46-O-CMC對HSFBs生長及形態(tài)的影響：以2×105個/ml的細(xì)胞密度分別接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，按分組加入不同濃度的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況。

1.5 ELISA法測定TGF-β1蛋白表達(dá)水平：以1×106個/ml的細(xì)胞密度分別接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，按分組加入不同濃度的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集培養(yǎng)上清。雙抗體夾心ELISA法檢測TGF-β1蛋白水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 引物設(shè)計與合成（上海生工生物技術(shù)有限公司完成）：

TGF-β1：上游引物：5'-ACCGGCCTTTCCTGCTTCT-3'；下游引物：5'-GGTCCTTGCGGAAGTCAATGT-3'；產(chǎn)物長度：156bp。

內(nèi)參β-actin：上游引物：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'；下游引物：5' -CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'；產(chǎn)物長度：205bp。

1.7 總RNA的提?。阂?×106個/ml的細(xì)胞密度分別接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，按分組加入不同濃度的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48h ，應(yīng)用Trizol試劑盒提取的總RNA（方法按說明書進(jìn)行）；并用紫外分光光度計定量，A260/A280值≥1.8的進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

1.8 熒光定量PCR 擴(kuò)增：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（合成cDNA）嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行；PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系(20μl) ：SYBR Premix Ex Taq II（10μl），PCR Forward Primer (0.8μl)， PCR Reverse Primer(0.8μl)， dH2O (6.4μl)， cDNA (2μl)。反應(yīng)條件：95℃30s，95℃5s， 60℃45s，共40 個循環(huán)。

以β-actin為內(nèi)參照，采用相對定量法，利用Ct值計算TGF-β1mRNA 的相對量。

用熒光定量PCR常用公式進(jìn)行運(yùn)算：

相對表達(dá)量=2-△△Ct

其中：△△Ct=[CT（待測基因）-CT（待測組β-actin）]-[CT（對照基因）-CT（對照組β-actin）]

1.9統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件處理，計量資料用表示；所有濃度組之間運(yùn)用單因素方差分析進(jìn)行比較，各組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（Least Significant Difference，LSD法），P<0.05 表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 6-O-CMC 對HSFBs生長及形態(tài)的影響：空白組細(xì)胞多呈典型的長梭形，胞體較大，胞漿豐富，生長旺盛，連接緊密，走向趨于一致，偶有有交叉重疊。藥物組，隨著6-O-CMC濃度的升高，細(xì)胞間出現(xiàn)空隙并逐漸擴(kuò)大，胞體變小，梭狀突起回縮，細(xì)胞雙極變得尖細(xì)，部分細(xì)胞呈單極或不規(guī)則形態(tài)生長，部分細(xì)胞脫落，懸浮于培養(yǎng)液（圖1）。

2.2 ELISA測定TGF-β1蛋白表達(dá)水平：與空白組相比，各藥物組TGF-β1蛋白表達(dá)量均降低（P<0.05），藥物濃度越高，表達(dá)量越低（P<0.05）（圖2，表2）。

2.3 熒光強(qiáng)度曲線：熒光PCR儀在擴(kuò)增過程中，會自動記錄每個循環(huán)的熒光強(qiáng)度。在最佳實(shí)驗(yàn)條件，相同擴(kuò)增效率的前提下，反應(yīng)體系產(chǎn)生一定強(qiáng)度的熒光信號所需的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Ct 值）與反應(yīng)體系中的原始模板數(shù)（cDNA）成反比。通過對熒光信號及擴(kuò)增進(jìn)程的實(shí)時監(jiān)測， 以熒光強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)建立坐標(biāo)， 標(biāo)本呈現(xiàn)典型的S 形曲線（圖3）。

2.4 初始cDNA相對量：根據(jù)熒光強(qiáng)度曲線中的Ct值，由上述公式算出初始cDNA 的相對量多少，即可代表原始TGF-β1 mRNA表達(dá)量多少。 結(jié)果顯示，與空白組相比，各藥物組TGF-β1 mRNA的表達(dá)量均減少（P<0.05），且藥物濃度越高，表達(dá)量越低（表1）（P<0.05）。

3討論

病理性瘢痕的防治一直是整形外科的難題之一。目前，主要應(yīng)用藥物局部注射治療。治療藥物主要包括皮質(zhì)激素類藥、抗腫瘤藥、免疫調(diào)節(jié)類藥物和中藥制劑等。但是，這些藥物的毒副作用較大，難以在臨床廣泛應(yīng)用。所以，在天然產(chǎn)物中尋找藥理作用明確且無明顯毒副作用的活性單體，一直是目前研究的熱點(diǎn)。

殼聚糖(chitosan)是地球上蘊(yùn)藏量僅次于纖維素的天然高分子化合物， 是目前已知的天然多糖中唯一的堿性多糖，它具有良好的生物相容性、生物降解性、無毒及抗菌性等特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛[7-8]。6-O-CMC是殼聚糖經(jīng)羧甲基化而得的一種水溶性多糖，與殼聚糖相比，其水溶性明顯提高， 在醫(yī)藥方面的用途更加廣泛[9]。研究表明羧甲基殼多糖對體外培養(yǎng)的人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成有抑制作用[10]，對角質(zhì)細(xì)胞生長有促進(jìn)作用[11]。6-O-CMC局部注射對兔耳增生性瘢痕的抑制作用與曲安奈德相近，局部注射能夠抑制兔耳增生性瘢痕[12]。這些均提示羧甲基殼聚糖在瘢痕治療領(lǐng)域有廣闊前景。

本實(shí)驗(yàn)基于以上研究，著眼于進(jìn)一步探究6-O-CMC發(fā)揮抑制增生性瘢痕作用的機(jī)制。選擇TGF-β1為檢測指標(biāo)，因其為HS發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子。它在HS組織中的表達(dá)與正常皮膚組織和正常術(shù)后瘢痕組織相比具有顯著差異，并在HS發(fā)展的早期階段起著關(guān)鍵性作用[13]。實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的人HSFBs為靶細(xì)胞，采用ELISE及熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測不同濃度6-O-CMC對TGF-β1蛋白及 mRNA表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，6-O-CMC三個藥物濃度組對HSFBs TGF-β1蛋白及mRNA的表達(dá)均有抑制作用，且隨著藥物濃度的增大，抑制作用增強(qiáng)；TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)量的變化具有一致性。這提示6-O-CMC可能通過抑制HSFBs TGF-β1 mRNA的表達(dá)進(jìn)而減少TGF-β1蛋白的表達(dá)，最終作用于HS組織，抑制其自身成纖維細(xì)胞的增值和膠原合成，此過程有些類似于正反饋?zhàn)饔?。但是?-O-CMC通過何種傳導(dǎo)途徑作用于HSFBs TGF-β1轉(zhuǎn)錄過程而減少其mRNA表達(dá)，以及6-O-CMC最佳作用濃度和作用時間確定尚需后續(xù)研究進(jìn)一步確定。

總而言之，通過本實(shí)驗(yàn)研究證明6-O-CMC對HSFBs TGF-β1蛋白及mRNA的表達(dá)均有抑制作用，在分子水平上初步探討了6-O-CMC對HSFBs的作用機(jī)制，為羧甲基殼聚糖類藥物的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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[收稿日期]2010-11-03[修回日期]2011-01-13

編輯/張惠娟