聯合運用凍融法和化學法去細胞同種異體神經修復兔面神經缺損

[摘要]目的：通過對去細胞同種異體神經處理方法的改進，找出一種修復兔面神經缺損的理想替代材料。方法：取24只兔子，將兔左側面神經上頰支切斷以造成面神經缺損1.0cm的模型，根據修復方法不同，隨機分成2組：實驗組為聯合運用凍融法和化學法去細胞同種異體神經修復組，對照組為自體面神倒置修復組，每組12只。術后3個月行大體觀察、神經電生理檢測、有髓神經纖維計數以及電鏡觀察，采用SPSS17.0軟件包對數據進行t檢驗，對面神經恢復情況進行綜合評價。結果：兩組兔子均存活，切口愈合良好，兔面形基本對稱；實驗組與對照組左側面神經上頰支傳導速度分別為(55.74±10.56)m/s及(61.34±9.72)m/s，差異無顯著性(P>0.05）；實驗組與對照組移植體遠端吻合口鄰近4.0mm段有髓神經纖維數量分別為(18173.62±918.38)n/mm2及(18601.21±982.31)n/mm2，差異亦無顯著性(P>0.05)；電鏡檢查結果相似。結論：聯合運用凍融法和化學法去細胞同種異體神經能滿意修復一定長度的面神經缺損，可以作為自體神經的一種有效替代物。

[關鍵詞]面神經；去細胞；神經移植；神經缺損；兔

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）02-0260-04

Repair of facial nerve defect with freeze-thaw and chemical acellular allogenic nerve in rabbits

LIU Guo-dong，ZHANG Rong-ming，CUI Chao，ZHANG Lin

(Department of Plastic and Cosmetic Surgery，The First Affiliated Hospital，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，Liaoning，China)

Abstract:ObjectiveThrough improve the preparative method of extracted acelluar nerve allograft，explore an new effective alternative material for the repair of facial nerve defect.MethodsTook 24 rabbits and a 1.0 cm facial nerve gap was made on the left buccal branch of the rabbits. According to different repair methods， the twenty-four rabbits were randomly divided into trial group that repaired facial nerve defect with freeze-thaw and chemical acellular allogenic nerve graft and control group that repaired facial nerve defect with inverted autologous facial nerve. Each group had 12 rabbits. Some examinations of the two groups were done on the 3th month postoperative， including visual observation， neural electrophysiological testing， image analysis of myelinated nerve fibers as well as electron microscope observation. Using t tests to comprehensive evaluation the data of the recovery of facial nerve with SPSS17.0 software package.ResultsTwo groups of rabbits were alive， the incision healed well and the facial shape of rabbits were basic symmetry. In the trial and control groups， the conduction velocity of buccal branch was (55.74 ±10.56)m/s and(61.34 ±9.72)m /s and there was no significant difference in both conditions(P>0.05)， the quantity of myelinated nerve fibers that distanced grafts distal anastomotic 4.0mm was (18173.62±918.38)n/mm2 and (18601.21±982.31)n/mm2 and there was no significant difference in both conditions(P>0.05) too. At the same time， the results of the two groups were also generally similar on electron microscope observation of the neighboring distal nerve of nerve graft.ConclusionFreeze-thaw and chemical acellular allogenic nerve allograft can satisfactory repair a certain length of facial nerve defects， and this is an effective substitute for autologous nerve graft in the repair of facial nerve defects.

Key words: facial nerve; acellular; neural transplantation; nerve defect; rabbit

面神經缺損的修復是臨床上的難題，目前自體神經移植為面神經缺損修復的“金標準”[1]，但是供區(qū)神經功能損傷和可以縫合的神經長度及直徑受限是不可以克服的障礙，而且來源有限。同種異體神經修復則可以克服上述缺點，具有來源充足、各種類型的神經段都可得到等優(yōu)點，但存在排斥反應。在同種異體神經處理其抗原性的方法上，許多學者做了大量的研究。現已證實同種異體神經的主要抗原成分中雪旺細胞的抗原性最強[2-3]。孟慶剛等[4]認為冷凍能降低雪旺細胞的活性或滅活移植體內大部分雪旺細胞，從而降低其抗原性。近年來，采用化學去細胞法處理同種異體神經能較好的降低反應原性[5]。本實驗聯合運用凍融法和化學法去細胞處理同種異體神經，并將制備的異體神經橋接面神經缺損，評價其再生效果。以期研制出一種理想的面神經移植替代物。

1材料和方法

1.1 主要試劑及儀器：Triton X-200、 sulfobetaine-10(SB-10)、sulfobetaine-16(SB-16)購自Sigma公司；BL-420F生物機能實驗系統（泰盟科技有限公司）；JEM-1200EX透著電鏡（日本電子公司）

1.2 實驗動物及分組：實驗動物為24只新西蘭大耳白兔（遼寧醫(yī)學院動物實驗中心提供），雄性，體重：2.0～2.4kg。實驗前觀察確認兔唇活動正常，無面癱表現，單籠喂養(yǎng)。將24只兔子隨機分成實驗組和對照組，每組12只，實驗組為聯合運用凍融法和化學法去細胞同種異體神經修復組，對照組為自體面神經倒置修復組。

1.3 供體取材及去細胞移植物的制備

1.3.1 供體取材：另取12只新西蘭大耳白兔，每只兔子稱重后，按0.2～0.3ml/kg肌肉注射速眠新行全身麻醉，麻醉后于左下肢作縱向切口，暴露并分離腓神經，切取長約2.0～3.0cm的神經，去除腓神經表面脂肪結締組織，沖洗后低溫保存。

1.3.2 去細胞移植物的制備：將所取的12根神經放入液氮中2min，隨即取出在37℃恒溫水浴中快速2min，重復前步驟3次，隨后置于0.05mol/L PBS液體沖洗15min，放入含125mmol/L SB-10的0.01mol/L PBS液體中振蕩萃取15h，再用0.05mol/L PBS液體沖洗15min，放入含0.6mmol/L SB-16，0.14％ Triton X-200的0.01mol/L PBS液體中振蕩萃取24h，用0.05mol/L PBS液體沖洗15min，放入含125mmol/L SB-10的0.01mol/L PBS液體中振蕩萃取7h，放入含0.6mmol/L SB-16，0.14％ Triton X-200的0.01mol/L PBS液體中振蕩萃取15 h，0.05mol/L PBS液反復沖洗后放入4℃無菌0.01mol/L PBS液（pH7.2）暫時保存。

1.4 手術方法

1.4.1 實驗組：將每只兔子稱重后，按0.2～0.3ml/kg肌肉注射速眠新行全身麻醉，麻醉后將兔子固定于手術臺上，術區(qū)備皮、消毒、鋪手術洞巾；從左側外耳道口下向口角做直線切口，仔細剝離咬肌表面的筋膜即可見頰支神經進入腮腺，仔細游離面神經上、下頰支，將上頰支游離出約3.0cm長，于中部切除1.0cm長的神經，制成神經缺損模型；用10-0的無損傷針線將聯合凍融法和化學法去細胞處理的同種異體神經與上頰支的神經斷端外膜縫合3～4針，逐層縫合切口。手術后慶大霉素噴灑切口預防感染。

1.4.2 對照組：將每只兔子稱重后，同法將左側面神經上頰支切取1.0cm，將自體面神經倒置縫合作為對照。手術后慶大霉素噴灑切口預防感染。

1.5 觀察指標

1.5.1 大體觀察：術后3個月觀察兔子是否存活，切口愈合情況以及功能恢復情況。觀察每組兔子胡須擺動以及口角歪斜情況，全麻后切開皮膚及皮下組織，顯露每只兔子移植體及其所在神經段，比較各組兔子的移植體外觀以及與周圍組織的黏連情況。

1.5.2 神經電生理檢測：全麻后切開皮膚及皮下組織，顯露左側面神經上頰支及其對應肌組織。先在移植體的近腦端安放刺激電極，在對應肌組織處安放記錄電極，以方波刺激，記錄該神經的誘發(fā)電位。再將刺激電極安放在移植體的遠腦端，記錄電極不變，方波刺激后記錄誘發(fā)電位。分別計算出各段的神經傳導速度。

1.5.3 有髓神經纖維計數：全麻后切開皮膚及皮下組織，顯露左側面神經上頰支，分別取移植體遠端吻合口鄰近4.0mm段神經。放入3%戊二醛溶液中固定20h，1%鋨酸中固定2h，乙醇、丙酮依次梯度脫水，EPON812環(huán)氧樹脂包埋，連續(xù)半薄切片，厚度1.0μm，行甲苯胺藍染色，光鏡下觀察有髓神經纖維，用圖像分析儀對神經軸突數目進行分析。

1.5.4 電鏡觀察：在環(huán)氧樹脂包埋的基礎上，做超薄切片，厚度60nm。經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛溶液雙重染色，在透射電鏡下觀察神經組織的結構。

1.6 統計學處理：采用SPSS17.0統計軟件進行統計處理，結果以均數±標準差（x±s）表示，采用成組設計資料兩樣本均數比較的t檢驗（P≤0.05差異有統計學意義，P>0.05差異無統計學意義）。

2結果

2.1 術后一般情況及大體觀察：術后3個月各組兔子均成活，切口愈合良好。實驗組和對照組兔子面部肌力恢復相似，術側的胡須擺動恢復明顯，術側的口角歪斜情況也有較大改善。兩組移植體以及所在神經段外觀正常，兩組移植體與周圍組織黏連均較輕。

2.2 神經電生理檢測：經神經電生理檢測，在實驗組和對照組中，移植物所在神經段均可誘發(fā)出動作電位，如圖1～2。實驗組的神經傳導速度平均值為(55.74±10.56)m/s，對照組的神經傳導速度平均值為(61.34±9.72)m/s，經成組資料均數t檢驗，t值為1.35，P>0.05，兩組之間的差異無統計學意義，如表1。

2.3 有髓神經纖維計數：經甲苯胺藍切片染色，光鏡下觀察發(fā)現實驗組和對照組中再生的神經纖維呈束狀分布，束內有大量的有髓神經纖維，如圖3～4；經圖像檢測分析，實驗組中神經纖維密度平均值為(18173.62±918.38)n/mm2，對照組中神經纖維密度平均值為(18601.21±982.31)n/mm2。經成組資料均數t檢驗， t值為1.10， P>0.05，兩組之間的差異無統計學意義，如表2。

2.4 電鏡觀察：經透射電鏡觀察，實驗組和對照組中有髓神經纖維髓鞘板層結構清晰度，髓鞘的直徑及厚度均無明顯差異，如圖5～6。

3討論

降低排斥反應是同種異體神經作為橋接物修復面神經缺損成功的關鍵。排斥反應主要是由于移植物的抗原性引起的，面神經中主要的抗原成分是雪旺細胞、髓鞘、神經束膜細胞及巨噬細胞表達供體的抗原，而雪旺細胞是排斥反應的主要目標，這是產生移植免疫的主要原因。當異體的神經與受體的神經縫合后，會發(fā)生一個快速的移植神經血管化過程。血管的形成，使相關的免疫細胞侵入移植物中[6]。雪旺細胞上MHCI類抗原的完全表達及MHCⅡ類抗原的不完全表達和血管內皮細胞MHCⅡ類抗原的表達并提呈抗原引起T淋巴細胞介導的免疫反應，發(fā)生移植排斥[7]。在降低同種異體神經抗原性的方法上，許多學者做了大量的研究。處理移植物的抗原性的方法有反復凍融法[8]、冷凍干燥法、放射法和化學去細胞法[9]等。反復凍融法雖然能殺死細胞，去除免疫原性，但不能清除細胞碎片，且常常引起基底膜碎裂。放射法雖不會引起組織形態(tài)的破壞，同時也能殺死細胞，去除免疫原性，但仍不能清除細胞碎片?；瘜W萃取的去細胞同種異體神經組織內的細胞成分可以較完全地清除，可以減少發(fā)生免疫排斥反應的可能性，同時保留能夠促進周圍神經生長的基底膜成分如層粘連蛋白等[10]。劉金超等[11]發(fā)現化學脫細胞同種異體神經移植物橋接周圍神經缺損后，對運動神經元胞體的存活具有良好的保護作用。牛宇等[12]發(fā)現，化學去細胞異體全面神經修復兔面神經缺損，可恢復面神經的運動及傳導功能。Hudson 等[13]探索出優(yōu)化的去細胞異體神經方案，聯合應用兩性離子的去污劑在磷酸緩沖液中萃取，經實驗得出此方法制備的去細胞異體神經無明顯的抗原性，移植后能有效促進受體的神經再生。

本實驗聯合運用凍融法和化學法制備去細胞同種異體神經，其原理是凍融處理后的神經其雪旺細胞和髓鞘己被損害，可降低其免疫原性，并且能保留基底膜完整，再利用較溫和的化學去污劑Triton X-200、SB-10、SB-16去除已經崩解的雪旺細胞及其髓鞘，進一步降低同種異體神經的免疫原性。該方法制備的移植物修復兔面神經1.0cm的缺損，結果顯示，術后3個月去細胞同種異體神經與周圍組織的粘連較輕微，神經連續(xù)性良好，近似正常神經外觀。神經電生理檢測表明，去細胞的同種異體神經傳導速度在術后第3個月，雖然其均值要比自體神經的傳導速度要慢，但兩者之間的差異已無統計學意義。甲苯胺藍染色觀察發(fā)現，去細胞神經移植體中央顯示有大量的再生神經纖維，神經束內有密集的有髓神經纖維分布，大多數有髓神經纖維已比較成熟，再生神經纖維已基本具備正常周圍神經的結構。電鏡觀察兩組有髓神經纖維髓鞘板層結構清晰度，髓鞘直徑及厚度亦相似，未見明顯的差異。這說明經過聯合運用凍融法和化學法去細胞處理的同種異體神經與自體神經一樣，是良好的神經缺損橋接修復材料。

在本實驗研究中證明聯合運用凍融法和化學法制備的去細胞同種異體神經具有良好的生物相容性，可以明顯地降低同種異體神經的抗原性，沒有明顯的免疫排斥反應。聯合運用凍融法和化學法制備的去細胞同種異體神經理論上能夠促進周圍神經的生長，可以作為自體神經的一種有效替代物。

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[收稿日期]2010-10-10[修回日期]2011-01-08

編輯/張惠娟