不同濃度乙醇對(duì)大鼠肌肉組織影響的探討

[摘要]目的：探討不同濃度乙醇對(duì)大鼠腓腸肌功能及組織學(xué)的影響。方法：選取等重的雄性SD大鼠75只，隨機(jī)分入A、B、C、D、E五組，在各組大鼠左側(cè)腓腸肌注射0.2ml濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，右側(cè)均注射相同量的生理鹽水。分別于注射后第3、7、14、21和28天分離大鼠左右側(cè)腓腸肌，檢測(cè)每只大鼠左右側(cè)腓腸肌的收縮力差（ΔF）及肌體積差（ΔV），并取標(biāo)本做HE染色，光鏡下觀察肌肉組織學(xué)變化。 結(jié)果：注射相同天數(shù)，實(shí)驗(yàn)組A、B、C、D組ΔF與ΔV隨乙醇濃度增加而明顯升高（P<0.05），D組與E組之間無(wú)顯著差異（P>0.05）；同一乙醇濃度下，三周內(nèi)，ΔF與ΔV均隨時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增加（P<0.05），與注射后第21天相比，注射后28天無(wú)明顯差異（P>0.05）。光鏡下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)及濃度增大腓腸肌纖維化程度明顯加重。結(jié)論：隨著濃度（50%～80%）增加，乙醇對(duì)大鼠腓腸肌損傷程度加重；當(dāng)乙醇濃度超過(guò)80%時(shí)，腓腸肌收縮功能基本喪失及組織學(xué)上基本纖維化。注射21天后，肌肉組織纖維化程度基本穩(wěn)定。

[關(guān)鍵詞]肌肉組織；乙醇；血管瘤

[中圖分類號(hào)]R732.2[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2011）02-0251-04

To approach the different concentrations of alcohol on the myoideum of rats

LI Yue-ling，CHEN Shi-hai，LIU Liu，DUAN Hong-yu

(Department of Plastic and Aesthetic Surgery，The First Affiliated Hospital，Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the efficacy of the different concentration of alcohol in treatment of the functions and histology of gastrocnemius muscle of rats. Methods75equiponderous male of SD rats which divided into A，B，C，D，E five groups randomly received the injection on the left of gastrocnemius muscle of rats in the 0.2ml of concentration of alcohol that is 50%、60%、70%、80%、90%，and on the right in the commensurate of physiological saline. Gastrocnemius muscle of rats was dissected 3，7，14，21 and 28 days later， and detected the difference of contractility (ΔF) and organism(ΔV). Extracted the specimens in HE and observed the change of muscle tissue in light microscope. Results The groups of D and E had no significant deviation（P>0.05）after the same of injection of days .In the homo- concentration of ethanol， ΔF and ΔV increased obviously over time（P<0.05）in three weeks. Compared with 21 days later， 28 days later had no significant deviation（P>0.05）. With time and concentration obviously increased，the gastrocnemius increased the degree of myofibrosis aggregately.ConclusionWhen the concentration of alcohol over 80%， the contractile function of gastrocnemius muscle loss and organization of basic fibrosis. The degree of myofibrosis stabled basically 21 days later.

Key words：muscle tissue；alcohol；hemangioma

無(wú)水乙醇腫瘤內(nèi)灌注技術(shù)是近年來(lái)臨床上用于治療海綿狀血管瘤尤其是肌肉血管瘤（intramuscular hemangioma，IMH）有效方法之一[1]，但由無(wú)水乙醇對(duì)病變周圍肌肉、神經(jīng)等正常組織的損傷在一定程度上影響了疾病的治療和病變部位功能的康復(fù)，在某些情況下其危害性甚至超過(guò)了原發(fā)病。因此，在無(wú)水乙醇治療腫瘤的過(guò)程中，了解無(wú)水乙醇對(duì)正常組織的影響，從而降低無(wú)水乙醇對(duì)病變周圍正常組織的損傷，保證病變部位的功能是目前臨床亟待解決的問(wèn)題。本研究旨在觀察大鼠腓腸肌對(duì)注射不同濃度乙醇的作用效果，探討不同濃度乙醇與骨骼肌之間的關(guān)系，為臨床應(yīng)用提供選擇依據(jù)。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：選取等重雄性SD大鼠75只，體重(180±10)g（廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），隨機(jī)分入A、B、C、D、E五組，每組15只。在各組大鼠左側(cè)腓腸肌注射0.2ml濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，右側(cè)均注射相同量的生理鹽水。

1.2 動(dòng)物模型的制備：實(shí)驗(yàn)中首先腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥(40mg/kg)；麻醉后，大鼠仰臥四肢外展位固定于解剖臺(tái)上，常規(guī)消毒鋪無(wú)菌巾單。于后肢小腿后側(cè)做縱形切口，分離、顯露并游離腓腸肌。根據(jù)分組不同，各組分別于第3、7、14、21和28天隨機(jī)取1只大鼠做腓腸肌各種檢測(cè)。

1.3 腓腸肌收縮力變化ΔF的測(cè)定：預(yù)先運(yùn)行PCLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，將大鼠固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。取后肢下段背側(cè)切口，切開皮膚分離出腓腸肌，于近端分離解剖出坐骨神經(jīng)，遠(yuǎn)端從肌腱止點(diǎn)處剪斷用絲線將其與肌張力換能器連接，給予50 g張力，使肌肉處于最適初長(zhǎng)度。分別給予單收縮刺激、強(qiáng)直刺激，記錄收縮曲線和測(cè)量數(shù)值，即得出腓腸肌收縮力。通過(guò)測(cè)量每組大鼠兩側(cè)腓腸肌收縮力，求出每組平均差值，即ΔF，。觀察在第1天、7天、14 天、21天和28天各組腓腸肌平均收縮力ΔF變化情況。

1.4 肌肉體積變化ΔV的測(cè)定：顯露、游離大鼠腓腸肌，在肌肉起止點(diǎn)處切斷肌肉附著部，除去肌肉上附著的組織后，將腓腸肌放入已裝有6ml甲醛的10ml量筒內(nèi)，觀察量筒刻度變化，即一側(cè)腓腸肌的體積。同樣測(cè)出另一側(cè)的體積，求出每組平均的差值，即ΔV。觀察在第3天、7天、14 天、21天和28天各組腓腸肌平均體積ΔV變化情況。

1.5 HE 染色切片分析：測(cè)量體積后切取注射部位腓腸肌組織，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、肌膜、肌纖維及細(xì)胞核的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS13.O統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用方差分析做組間比較及各時(shí)間點(diǎn)間比較，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大體觀察結(jié)果：注射乙醇后，大鼠后肢活動(dòng)頻率和幅度均有不同程度減少，以術(shù)后3～4日最為明顯，其中D組、E組后肢活動(dòng)減少程度較A組、B組、C組明顯。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未見明顯活動(dòng)及覓食障礙。活體切取腓腸肌，與自身對(duì)照側(cè)相比，實(shí)驗(yàn)側(cè)肌肉組織顏色蒼白、彈性降低，質(zhì)地變硬。

2.2 腓腸肌收縮力ΔF：分別于注射不同濃度乙醇術(shù)后，第3、7、14、21、28天在活體狀態(tài)下手術(shù)分離出兩側(cè)腓腸肌，通過(guò)肌張力轉(zhuǎn)換器，測(cè)量其每側(cè)收縮力，通過(guò)計(jì)算得出兩側(cè)變化值。 結(jié)果顯示：不同的處理組間P=0.000，不同的乙醇濃度對(duì)腓腸肌收縮力ΔF的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D組與E組間P=0.993，80%與90%乙醇濃度對(duì)腓腸肌ΔF的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同的時(shí)間手術(shù)分離組間P=0.000，說(shuō)明時(shí)間對(duì)腓腸肌收縮力ΔF的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；21天與28天組間P=0.933，第21天與28天手術(shù)對(duì)腓腸肌ΔF的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

實(shí)驗(yàn)側(cè)/自身對(duì)照收縮力，即為腓腸肌收縮力變化百分率，由各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間的腓腸肌收縮力改變可作出腓腸肌收縮力變化趨勢(shì)見圖，見圖1。

通過(guò)觀察大鼠腓腸肌ΔF，了解肌肉收縮力的變化，可進(jìn)一步反映出腓腸肌功能的變化情況。隨乙醇濃度的增加A-D組實(shí)驗(yàn)側(cè)肌肉收縮力減弱，表明不同濃度（50%～80%）乙醇可以導(dǎo)致肌肉收縮力變化不同，隨著濃度升高，收縮力降低，D組與E組之間ΔF沒有顯著差異，表明注射超過(guò)80%濃度乙醇腓腸肌基本纖維化；第21與第30天各組腓腸肌收縮力ΔF相比沒有顯著差異，表明注射乙醇21天后，腓腸肌組織纖維化程度基本穩(wěn)定。

2.3、腓腸肌體積ΔV：分別于注射不同濃度乙醇術(shù)后，第3、7、14、21、28天在活體狀態(tài)下手術(shù)切取大鼠兩側(cè)腓腸肌，待測(cè)量完收縮力后，迅速用量筒測(cè)量其體積，通過(guò)計(jì)算得出兩側(cè)腓腸肌體積變化ΔV。結(jié)果顯示：不同的處理組間P=0.000，不同的乙醇濃度對(duì)腓腸肌體積ΔV的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D組與E組間P=0.968，80%與90%乙醇濃度對(duì)腓腸肌體積ΔV的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同的時(shí)間手術(shù)分離組間P=0.000，說(shuō)明時(shí)間對(duì)腓腸肌體積ΔV的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；21天與28天組間P=0.939，第21天與28天手術(shù)對(duì)腓腸肌體積ΔV的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

實(shí)驗(yàn)側(cè)/自身對(duì)照體積，即為腓腸肌體積變化百分率，由各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間的腓腸肌體積改變可作出變化趨勢(shì)圖，見圖2。

由腓腸肌體積變化趨勢(shì)圖可見：在同一乙醇濃度下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，腓腸肌體積逐漸縮小，第21天后，體積變化不明顯。一周以后，隨著注射乙醇濃度升高，腓腸肌體積變化增大，乙醇濃度超過(guò)80%，腓腸肌體積變化不明顯。

2.4 組織學(xué)觀察：腓腸肌組織HE染色，光鏡下可見：

2.4.1 空白組/自身對(duì)照側(cè)：肌細(xì)胞顯紅色，肌細(xì)胞核位于細(xì)胞周邊肌膜下，顯藍(lán)褐色。常態(tài)下肌細(xì)胞排列整齊、大小規(guī)則，肌節(jié)完整可見（圖3）。

2.4.2 A組（50%乙醇）：肌細(xì)胞排列整齊，肌纖維變細(xì)，肌膜完整，肌間隙稍變寬，細(xì)胞核可見（圖4）。

2.4.3 B組（60%乙醇）：肌細(xì)胞排列、形態(tài)稍絮亂，肌纖維少許斷裂、纖維化，肌膜不完整，肌間隙變寬，細(xì)胞核可見（圖5）。

2.4.4 C組（70%乙醇）：肌細(xì)胞排列絮亂，形態(tài)不規(guī)則，肌纖維斷裂、纖維化明顯，肌膜被破壞，肌間隙較寬，細(xì)胞核可見（圖6）。

2.4.5 D組（80%乙醇）：肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全破壞，呈壞死狀態(tài)，繼之壞死區(qū)纖維機(jī)化，肌膜完全被破壞，細(xì)胞核碎裂消失（圖7）。

2.4.6E組（90%乙醇）：肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全破壞，成纖維化，肌膜完全被破壞，肌纖維斷裂、溶解，細(xì)胞核碎裂消失（圖8）。

3討論

高濃度乙醇局部注射可以使受注射部位組織細(xì)胞脫水、蛋白質(zhì)發(fā)生凝固性壞死，產(chǎn)生無(wú)菌性炎癥，進(jìn)一步會(huì)發(fā)生纖維化和攣縮。自1983年日本杉浦倍之首先采用超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮肝穿刺腫瘤內(nèi)注入無(wú)水酒精療法(PEI)治療肝癌以來(lái)。國(guó)內(nèi)外已逐步將無(wú)水乙醇應(yīng)用于臨床上，用于治療肝血管瘤[2]、肝囊腫[3]、腎囊腫[4]、消化道出血[5]以及海綿狀血管瘤[6]等疾病。由于灌注無(wú)水乙醇后，一些不可控因素，常導(dǎo)致周圍正常組織的變性壞死，從而限制乙醇在臨床上的廣泛應(yīng)用。

肌肉內(nèi)血管瘤(IMH)是位于肌內(nèi)呈彌漫性生長(zhǎng)的血管瘤，比較少見，約占海綿狀血管瘤的0.8%[7]，常見于四肢，其次為面部及軀干[7]，多同時(shí)侵犯皮下[10]、肌肉組織，甚至侵犯至骨膜。目前乙醇灌注是治療IMH的主要手段之一[9]。IMH一般位置比較深，血管畸形也比較嚴(yán)重，不但危及患者身體健康，治療上也有很大的風(fēng)險(xiǎn)，尤其在乙醇注射的劑量較難把握，劑量小時(shí)效果不明顯，劑量過(guò)大對(duì)周圍正常組織損傷嚴(yán)重，導(dǎo)致器官功能障礙，極易出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥。臨床有必要探索出既能治愈血管瘤，又不增加并發(fā)癥的乙醇治療濃度。

本實(shí)驗(yàn)將不同濃度乙醇注入大鼠肌肉組織來(lái)觀察肌肉體積變化和肌肉收縮力改變；同時(shí)組織切片觀察肌肉組織學(xué)改變情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇濃度在50%～80%時(shí)，隨著注射乙醇濃度增加，大鼠骨骼肌體積縮小和肌力減弱的程度均呈正增加，在光鏡下肌肉組織破壞逐漸加重（見圖Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ）；當(dāng)乙醇濃度超過(guò)80%時(shí)，大鼠骨骼肌體積縮小和肌力減弱的程度不明顯（P>0.05），光鏡下見肌肉組織基本纖維化（見圖Ⅴ、Ⅵ）。說(shuō)明乙醇濃度<80%時(shí)，隨乙醇濃度增加對(duì)肌肉組織破壞程度加重；當(dāng)乙醇濃度>80%時(shí)，肌肉組織基本完全被纖維化。毛雅君 許光旭等[11]研究報(bào)告也與實(shí)驗(yàn)的結(jié)果類同。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)得知，當(dāng)注射乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，大鼠腓腸肌組織纖維化已達(dá)到最大值，再增加乙醇的濃度，只會(huì)增加對(duì)周圍正常組織的損傷，而腓腸肌纖維化程度不在改變。通過(guò)乙醇與肌肉關(guān)系的這一聯(lián)系，為臨床利用無(wú)水乙醇治療IMH提供一個(gè)參考。

注射低濃度乙醇可使肌肉保有一定的功能，在一定的程度上還使肌肉體積變小，后期肌肉體積不易恢復(fù)等特點(diǎn)，可為臨床上治療良性咬肌肥厚常存在作用不持久等缺點(diǎn)[12]提供一定參考。

本實(shí)驗(yàn)初步觀察了不同濃度乙醇對(duì)大鼠骨骼肌功能一定的影響。如果要進(jìn)行更為全面的觀察，尚須進(jìn)一步研究骨骼肌的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)，生化指標(biāo)的變化，同時(shí)還需更加深入的進(jìn)行研究。

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[收稿日期]2010-10-09 [修回日期]2010-12-23

編輯/張惠娟