增強型綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的研究

[摘要]目的：以重組腺病毒（Ad）為載體，將增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因轉(zhuǎn)染至小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（mMSCs）中，為MSCs體內(nèi)示蹤提供實驗基礎(chǔ)。方法：用全骨髓細胞貼壁法分離純化小鼠MSCs并體外擴增、鑒定，以重組綠色熒光蛋白基因的腺病毒（Ad-EGFP）轉(zhuǎn)染，并用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染率，CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染細胞的增殖活性。結(jié)果：轉(zhuǎn)染后10h MSCs開始表達熒光，6～8天達高峰，轉(zhuǎn)染率可達92.3％，28天仍有表達；轉(zhuǎn)染細胞的增殖活性和未轉(zhuǎn)染細胞無統(tǒng)計學差異。結(jié)論：Ad-EGFP能高效、安全的轉(zhuǎn)染mMSCs。

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細胞；增強型綠色熒光蛋白；重組腺病毒；基因轉(zhuǎn)染

[中圖分類號]R394.2[文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2011）02-0257-04

Study on the transfection of enhanced green fluorescent protein gene into murine marrow mesenchymal stem cells

NING Chang，HU Kai-xun，YU Chang-lin

(Department of Heamatologe，Affiliated Hospital of Academy of Military Medical Science，Beijing 100071，China)

Abstract:ObjectiveTo found the experimental basis of MSCs tracer in vivo，with enhanced green fluorescent protein gene (EGFP)mediated by recombinant adenovirus(Ad) vector transfected murine bone marrow mesenchymal stem cells(mMSCs).MethodsThe mMSCs were separated and enriched by using bone marrow adherent culture and identificated in vitro， to observe the efficiency of transfection of Ad-EGFP by fluorescence microscope and flow cytometry， CCK-8 applied to assay cell proliferation activity.Results10h after transfection MSCs began to express fluorescent， 6 to 8 days reached the peak infection rate of 92.3%， 28 days still expression.Proliferation of transfected cells and untransfected cells no significant difference. Conclusion Ad-EGFP can transfect mMSCs effectively and safly.

Key words:bone marrow mesenchymal stem cells;enhanced green fluorescent protein gene; recombinant adenovirus;gene transfection

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymcal stem cells，BMSCs）是骨髓基質(zhì)細胞，因具有較強的增殖及多向分化潛能[1]，成為細胞移植的理想種子細胞，又因其免疫原性低，在多種疾病的治療中起著重要的作用，在美容醫(yī)學方面有一定的應(yīng)用前景。但其在體內(nèi)的遷徙、定植、增殖過程尚不十分明了，因此有效的分子標記對其體內(nèi)外示蹤有重要的意義。增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）是一種新型的報告基因，具有熒光穩(wěn)定、無毒、使用方便等特性，可對活細胞實時定位觀察。本實驗以腺病毒為載體，介導EGFP轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（mMSCs），現(xiàn)將實驗結(jié)果報道如下。

1材料和方法

1.1 材料：LG-DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司），胎牛血清FBS（Hyclone公司），1-甲基-3-異丁基黃嘌呤（Sigma公司），F(xiàn)ITC標記兔抗鼠CD34、CD45、CD105、CD44（BD公司），0.25%胰蛋白酶（Sigma公司），Cell Count Kit-8（CCK-8）試劑盒（Dojindo公司），X90-3潔凈工作臺（北京半導體設(shè)備廠），37℃、5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（Therma Forma公司），25cm2、75cm2細胞培養(yǎng)瓶（Coring公司），6孔板、96孔板（Costar公司），常溫臺式離心機（Heraeus sepatech公司），倒置顯微鏡（Olympus公司），倒置熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)（Nikon公司），F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀（BD公司），ELX800酶標儀（BioTek公司），Ad-EGFP由本實驗組前期構(gòu)建。

動物：雄性C57BL/6小鼠，5～7周齡，體重19～21g，購于解放軍軍事醫(yī)學科學院動物中心（動物合格證號：SCXK-(軍)2007-004）。實驗動物在軍事醫(yī)學科學院動物中心二級清潔動物房飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分離和培養(yǎng)：用頸椎脫臼引頸法處死小鼠，75%乙醇中浸泡5min，在超凈臺內(nèi)無菌分離小鼠的股骨和脛骨，用LG-DMEM沖出骨髓腔內(nèi)的骨髓，經(jīng)過200目細胞篩過濾，制成單細胞懸液，1 300rpm/5min離心，去除上清，用PBS重懸細胞，計數(shù)，以1.5×106/cm2的密度接種于完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基），置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h及72h各換液一次，棄去舊培養(yǎng)液，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，去掉非貼壁細胞，以后每3天更換一次培養(yǎng)液，待細胞接近90%融合時棄去培養(yǎng)液，以0.25%胰蛋白酶常溫下消化并傳代，用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，按照1﹕2接種于新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 MSCs的細胞表型鑒定：取第2代MSCs，用0.25%胰酶消化后制成單細胞懸液，流式細胞儀檢測細胞表面CD34、CD45、CD105、CD44的表達。

1.2.3 MSCs的轉(zhuǎn)化實驗：取第2代MSCs，分別用成骨誘導體系（DMEM、10%胎牛血清、β-甘油磷酸10 mmol/L、維生素C 50μmol/L、地塞米松 0.25μmol/L）[2]及成脂誘導體系（DMEM、10%胎牛血清、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤0.5mmol/L、吲哚美辛 50μmol/L、地塞米松 0.1μmol/L）[2-3]誘導。成骨誘導時細胞接種密度為5×103/cm2，誘導3周后以Von Kossa染色；成脂誘導時細胞接種密度為1×104/cm2，誘導2周用油紅O染色。

1.2.4 EGFP轉(zhuǎn)染MSCs：取第2代MSCs，以1×106細胞密度接種于6孔板中，分別加入感染復(fù)數(shù)（MOI）為50、150、300的Ad-EGFP在完全培養(yǎng)基中孵育48h，其后更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞的生長及熒光表達情況，待熒光穩(wěn)定表達后，以流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染率。

1.2.5 轉(zhuǎn)染后細胞增殖能力檢測：取最佳感染復(fù)數(shù)Ad-EGFP轉(zhuǎn)染的MSCs，以1×107/ml濃度接種于96孔板中，每孔100μl，同時取第2代MSCs，以相同濃度及體積接種于96孔板中，每天相同時間每組各取5孔細胞，加入10μl CCK-8孵育4h，用酶標儀檢測490nm吸光度值（OD值），連續(xù)7天繪制細胞生長曲線。

1.2.6 統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，采用配對t檢驗。

2結(jié)果

2.1 MSCs的分離和培養(yǎng)：在倒置顯微鏡下觀察，接種24h后細胞開始貼壁，多為小圓形及多角形，培養(yǎng)至第7天多數(shù)細胞伸展呈梭形并呈集落式生長，在11天左右可融合達瓶底80%～90%。傳代培養(yǎng)至第2代時細胞形態(tài)趨于統(tǒng)一，呈現(xiàn)為長梭形細胞束裝排列（圖1）。

2.2 MSCs的細胞表型鑒定：用流式細胞儀檢測第2代MSCs細胞表型，MSCs高表達CD105(69.01%)、CD44(95.65%)，低表達CD34(0.76%)、CD45(23.37%)（圖2）。

2.3 MSCs的轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果：成骨誘導3周后以Von Kossa染色，可見染色陽性的骨結(jié)節(jié)；成脂誘導后2周可見油紅O染色的紅色脂肪細胞（圖3）。

2.4 EGFP轉(zhuǎn)染MSCs：轉(zhuǎn)染后10h可見有綠色熒光表達，隨時間推移逐漸增強，第7天后表達率達最高并趨于穩(wěn)定，體外培養(yǎng)28天仍可見熒光。轉(zhuǎn)染率隨感染復(fù)數(shù)的增加而增加，但MOI為300時鏡下觀察，細胞形態(tài)變化較明顯，表現(xiàn)為細胞變形、漂浮，提示細胞受損。MOI為150時，轉(zhuǎn)染率較高，且細胞形態(tài)變化不大。經(jīng)流式細胞儀檢測三組轉(zhuǎn)染率分別為65.7%、92.3%、94.6%（圖4）。

2.5 轉(zhuǎn)染細胞增殖能力檢測結(jié)果：MOI為150轉(zhuǎn)染的MSCs與未轉(zhuǎn)染的MSCs的OD值差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。兩組生長曲線見圖5。

3討論

3.1 BMSCs是骨髓中的非造血干細胞，它來源于中胚層，由于具有橫向或跨胚層向多種組織細胞分化的能力，同時易于分離獲取、體外擴增，并具備低免疫原性、易于外源基因轉(zhuǎn)染和表達等優(yōu)點，近年來已成為組織工程、基因治療及細胞移植等領(lǐng)域中的研究熱點。又由于現(xiàn)在我國美容醫(yī)學的快速發(fā)展，使得擁有上述優(yōu)勢的MSCs在美容整形方面有了巨大的運用前景。由于小鼠和人類基因的同源性高，因此對mMSCs的研究是人體研究的基礎(chǔ)。

3.2 目前，対BMSCs的分離方法主要有4種：全骨髓細胞貼壁分離法、密度梯度離心分離法、免疫磁珠分選法和流式細胞儀分選法[4]，后兩種方法雖可獲得較高純度MSCs，但對實驗條件要求較高，在分離過程中対細胞活性影響較大[5]；而密度梯度離心分離法雖簡單易行，所得MSCs純度較高，但對骨髓需要量較大，對于小鼠而言，工作量明顯加大，不易獲取足夠量的MSCs。有文獻報道將幾種分離方法配合使用[6-8]，因存在費時、耗力、增加實驗的成本、時間和實驗難度，故未予采用。本實驗單純采用貼壁分離法，起初分離的細胞中包括紅細胞、白細胞、MSCs、巨噬細胞和單核細胞，它們的貼壁能力各不相同，由于紅細胞、白細胞為懸浮生長，多次換液后基本可清除，而MSCs、巨噬細胞和單核細胞雖然均為貼壁生長，但三者在培養(yǎng)板上的粘附性不同，采用胰酶消化傳代時，粘附性較弱的MSCs易被洗脫，而后兩種細胞粘附性強，不易被洗脫，因此隨舊培養(yǎng)瓶被棄去。因此通過換液和消化傳代的方式去除雜細胞，可獲得較純的MSCs，培養(yǎng)時使用10%Hyclone頂級胎牛血清完全培養(yǎng)基，保證了細胞的良好生長。本實驗方法不僅操作簡單、對實驗條件要求低，所獲MSCs也達到實驗要求，可用于mMSCs的分離和培養(yǎng)。

3.3 由于MSCs缺乏特異性標記，因此鑒定主要是從形態(tài)、細胞表型及多向分化能力三個方面著手，本實驗中培養(yǎng)細胞由小圓形逐漸長成形態(tài)均一、排列有序的梭形細胞；低表達CD34、CD45，高表達CD105、CD44以及有成骨、成脂轉(zhuǎn)化能力，與文獻報導一致[2，9]，表明所獲細胞是骨髓間充質(zhì)干細胞。

3.4 細胞移植的研究中，體內(nèi)外示蹤是一個重要環(huán)節(jié)。目前常用的示蹤劑有GFP、Brdu、DAPI等[10-11]，其中GFP由于對細胞無毒、不影響細胞的生長和功能、產(chǎn)生熒光不需添加底物、生色基團的形成無種屬特異性等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用作原核細胞和真核細胞的標記蛋白。而EGFP是在GFP基因的基礎(chǔ)上，替換了影響熒光表達效率的堿基后翻譯的產(chǎn)物，因此其熒光強度較GFP顯著提高，可高達35倍[12]，更易于熒光顯微鏡和流式細胞儀分析。本實驗采用EGFP標記MSCs，轉(zhuǎn)染后10h即可見熒光表達，第7天表達至最高峰，并可穩(wěn)定表達28天。而且熒光強度高，無論是在熒光顯微鏡下觀察，還是使用流式細胞儀分析，均能獲得理想效果，證實EGFP可用于mMSCs的體內(nèi)外示蹤。

3.5 目前常用的綠色熒光蛋白標記干細胞的方式有3種：質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染、病毒載體轉(zhuǎn)染和綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因動物。質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染由于穩(wěn)定性較差、轉(zhuǎn)染率低等不足，使用受到限制。綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因動物由于實驗周期長、成本過高，也不易推廣。而腺病毒轉(zhuǎn)染效率高、表達穩(wěn)定、其DNA不整合到宿主基因組、轉(zhuǎn)染后不改變MSC的表型及多向分化潛能[13]，應(yīng)用較廣泛[14-16]，本實驗中使用Ad-EGFP轉(zhuǎn)染mMSCs， 效果好、操作簡便，在MOI為150時轉(zhuǎn)染效率達92.3%，且轉(zhuǎn)染后細胞病理提示受損細胞少，細胞增殖能力未受影響，與其他兩種標記方式相比，試驗周期短、操作簡便、成本較低，表明是安全、可靠、高效的方法。為進一步研究MSCs在體內(nèi)的組織修復(fù)等研究提供了實驗基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2010-09-28 [修回日期]2011-01-08

編輯/張惠娟