雞miRNA let-7b前體區(qū)單核苷酸多態(tài)性與生長肉用性狀關(guān)聯(lián)分析

畢圣群，岳孝亭，許嘉慧，張綺瓊，楊昌盛，張宇玲，張如濤，周榮燦，林樹茂

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)系，廣東佛山528000）

miRNA是一類長約18～25 nt（大約22 nt）的小分子單鏈非編碼RNA，是一類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子（Post transcriptional regulatory factor），在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及個體成長發(fā)育、機(jī)體營養(yǎng)代謝等過程中扮演重要角色［1-3］。

自REINHART等［4］在2000年初次在線蟲中發(fā)現(xiàn)let-7以來，現(xiàn)已成為miRNA研究領(lǐng)域中最為普遍的一種。let-7具有高度時序性、組織特異性、保守性等特點，在細(xì)胞的分化、增殖、凋亡和癌細(xì)胞的浸潤過程中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA let-7是癌癥治療和免疫反應(yīng)的關(guān)鍵參與者，具有作為新的免疫治療靶標(biāo)的潛在作用［5］。最近的研究結(jié)果確定let-7家族是調(diào)節(jié)B細(xì)胞抗體產(chǎn)生和巨噬細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)鍵因素［6］。

研究表明，let-7b作為let-7家族的重要成員，對雞的生長發(fā)育以及骨骼肌的形成發(fā)揮著十分重要的作用［7-9］。有研究表明，位于miRNA前體區(qū)的單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism，SNP）很可能會對miRNA的生成加工過程造成不同程度的影響，從而改變成熟miRNA產(chǎn)量，進(jìn)而影響miRNA對靶基因的調(diào)控作用［10］。2007年DUAN等［11］對位于miR-125a前體區(qū)的單個SNP進(jìn)行了詳盡的研究，隨后發(fā)現(xiàn)該SNP不僅能夠影響pri-miRNA到pre-miRNA的加工過程，并且會影響miR-125a對其靶基因發(fā)揮的調(diào)控作用。

本研究以杏花雞和隱性白洛克雞雜交所得F2代肉雞生長性狀和肉用性狀資料為研究素材，對let-7b前體區(qū)SNP多態(tài)位點（rs 71292045、rs 71292453）不同基因型與雞的生長肉用性狀（活重LW、脛長SL、胸寬CW、胸深CD、體斜長BSL、胸角CA、屠體重DW、胸肉重BMW、腿肉重LMW、腿肌率LWR、胸肌率BMR、腿胸比RLB等）的影響進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在進(jìn)一步探討let-7b對雞的生長發(fā)育和肉用性狀的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本研究采用的實驗動物為杏花雞和隱性白洛克雞雜交得到的F2代肉雞。隱性白洛克雞是一種快大型肉雞，而杏花雞是中國廣東本土的地方品種肉雞。在相同的飼養(yǎng)管理條件下，將上述F2代資源群放置于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)院種雞場，采用平養(yǎng)的飼養(yǎng)方式，飼喂符合國際配方標(biāo)準(zhǔn)的玉米—豆粕型飼料。

1.2 測定指標(biāo)

對資源群在飼養(yǎng)到3月齡時進(jìn)行屠宰取樣，測量的數(shù)據(jù)包括活重LW、脛長SL、胸寬CW、胸深CD、體斜長BSL、胸角CA等體尺指標(biāo)，并測定和計算以下屠體性狀：屠體重DW、胸肉重BMW、腿肉重LMW、腿肌率LWR、胸肌率BMR、腿胸比RLB等。測定方法如下：

活重LW：指在屠宰前停飼12 h后的重量；

脛長SL：脛部上關(guān)節(jié)到第三、第四趾間的直線距離；

胸寬CW：用卡尺度量兩肩關(guān)節(jié)間距離；

胸深CD：用卡尺度量第一胸椎至胸骨前緣間的距離；

體斜長BSL：用皮尺測量鎖骨前上關(guān)節(jié)到坐骨結(jié)節(jié)間的距離；

胸角寬CA：用胸角器在龍骨前緣測量兩側(cè)胸部角度；

屠體重DW：禽體放血、拔毛后的重量（濕拔法需瀝干）；

胸肉重BMW：將屠體胸肌剝離下的重量；

腿肉重LMW：將禽體腿部去皮，去骨的肌肉重量；

腿肌率LWR：腿肌重/全凈膛重×100%；

胸肌率BMR：胸肌重/全凈膛重×100%；

腿胸比RLB：腿肉重/胸肉重×100%。

1.3 SNP突變位點基因型頻率與基因頻率計算

通過PCR擴(kuò)增和測序，篩選出let-7b基因前體區(qū)的SNP多態(tài)性，并在此基礎(chǔ)上計算出杏花隱性白F2代全同胞家系資源群中各位點的基因型頻率和等位基因頻率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)在Excel中建表錄入數(shù)據(jù)并計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差，采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 20.0對各項指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

2 實驗結(jié)果

2.1 let-7b前體區(qū)SNP多態(tài)位點的基因型和基因頻率

通過PCR擴(kuò)增和測序，在let-7b基因前體區(qū)篩選出2個SNP，包括rs71292045和rs71292453。其中SNP位點rs71292045對應(yīng)的基因型為AA、GA、GG，SNP位點rs71292453對應(yīng)的基因型為TT、TC、CC，上述SNP位點的基因型頻率、基因頻率見表1。

表1 let-7b前體區(qū)SNP多態(tài)位點的基因型和基因頻率

由表1可知，突變位點rs71292045的基因型AA、GA、GG的基因型頻率分別為0.11、0.35、0.54，基因頻率A為0.28，G為0.72；突變位點rs71292453的基因型TT、TC、CC的基因型頻率分別為0.38、0.31、0.31，基因頻率T為0.54，C為0.46。由此可知兩個突變位點rs71292045和rs71292453的優(yōu)勢基因型分別是GG和TT。

2.2 let-7b前體區(qū)SNP位點rs71292045不同基因型與生長肉用性狀關(guān)聯(lián)分析

杏花雞×隱性白洛克雞F2資源群let-7b前體區(qū)SNP位點rs71292045不同基因型與生長肉用性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表2。

表2 let-7b前體區(qū)SNP位點rs71292045不同基因型與生長肉用性狀關(guān)聯(lián)分析

由表2可知，該位點不同基因型AA、GA、GG的胸肌率分別為6.70%、7.05%、6.68%，差異極顯著（P＜0.01），GA極顯著高于AA、GG；各基因型的腿胸比分別為1.32%、1.24%、1.30%，差異極顯著（P＜0.01），AA極顯著高于GA。

結(jié)果顯示，該位點不同基因型的宰前活重、脛長、胸寬、胸深、體斜長、胸角寬、屠體重、胸肉重、腿肉重、腿肌率等差異不顯著（P＞0.05）。不同基因型AA、GA、GG的3月齡活重分別為1.57 kg、1.48 kg、1.50 kg，存在一定差異，但差異不顯著（P＞0.05），沒有統(tǒng)計學(xué)意義；各基因型的脛長分別為86.38 mm、86.57 mm、86.57 mm，差異不顯著（P＞0.05）；各基因型的胸寬分別為 67.44 mm、66.48 mm、66.15 mm，差異不顯著（P＞0.05）；各基因型的胸深分別為 95.30 mm、95.16 mm、95.18 mm，差異不顯著（P＞0.05）；各基因型的體斜長分別為23.25 cm、22.90 cm、22.77 cm，差異不顯著（P＞0.05）；各基因型的胸角分別為60.33°、59.74°、60.41°，差異不顯著（P＞0.05）；各基因型的屠體重分別為 1373.96 g、1317.17 g、1328.13 g，差異不顯著（P＞0.05）；各基因型的胸肉重分別為 91.37 g、91.89 g、88.18 g，差異不顯著（P＞0.05）；各基因型的腿肉重分別為120.856 g、113.538 g、114.718 g，差異不顯著（P＞0.05）；各基因型的腿肌率分別為8.76%、8.64%、8.64%，差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 let-7b前體區(qū)SNP位點rs71292453不同基因型與生長肉用性狀關(guān)聯(lián)分析

杏花雞×隱性白洛克雞F2資源群let-7b前體區(qū)SNP位點rs71292453不同基因型與生長肉用性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表3。

表3 let-7b前體區(qū)SNP位點rs71292453不同基因型與生長肉用性狀關(guān)聯(lián)分析

由表3可知：該位點不同基因型TT、TC、CC的胸肉重分別為85.02 g、93.78 g、92.51 g，差異極顯著（P ＜ 0.01），TC、CC 顯著高于 TT；各基因型的腿肉重分別為 111.31 g、115.03 g、120.71 g，差異顯著（P＜0.05），CC顯著高于TT；各基因型的腿肌率分別為8.52%、8.55%、8.93%，差異極顯著（P＜0.01），CC極顯著高于 TT、TC；各基因型的胸肌率分別為 6.54%、7.07%、6.88%，差異極顯著（P＜0.01），TC、CC極顯著高于CC；各基因型的腿胸比分別為1.31%、1.22%、1.31%，差異極顯著（P＜0.01），TT、CC極顯著高于TC。

統(tǒng)計結(jié)果表明，該位點不同基因型對宰前活重、脛長、胸寬、胸深、體斜長、胸角寬、屠體重等差異不顯著（P＞0.05）。不同基因型 TT、TC、CC 的 3 月齡活重分別為 1.46 kg、1.50 kg、1.54 kg，差異不顯著（P＞0.05）；各基因型的脛長分別為 85.76 mm、86.98 mm、88.21 mm，差異不顯著（P＞0.05）；各基因型的胸寬分別為 65.41 mm、67.05 mm、67.27 mm，差異不顯著（P＞0.05）；各基因型的胸深分別為 94.30 cm、96.87 cm、94.77 cm，差異不顯著（P＞0.05）；各基因型的體斜長分別為 22.67 cm、22.92 cm、23.12 cm，差異不顯著（P＞0.05）；各基因型的胸角分別為 60.10°、60.05°、60.41°，差異不顯著（P=0.891）；各基因型的屠體重分別為 1 306.10 g、1 342.67 g、1 356.12 g，差異不顯著（P＞0.05）。

3 分析與討論

有研究表明，雞miRNA let-7b可通過靶向調(diào)控IGF2BP3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平來影響雞成肌細(xì)胞的增殖［12］。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，let-7b可通過調(diào)控GHR基因的表達(dá)，影響SLD雞骨骼肌發(fā)育過程［7］。研究顯示，位于miRNA上的SNP位點的不同基因型對動物的生長性狀存在一定的相關(guān)影響和調(diào)控作用。豬（Sus scrofa）的每窩產(chǎn)仔數(shù)與位于miR-27a基因上的T/C堿基位點突變有關(guān)［13］；HONG等研究了位于豬miR-1基因上的兩個SNP，結(jié)果顯示，這兩個SNP不僅能夠降低前體區(qū)的miR-1與成熟miR-1的基因表達(dá)，而且與豬肉Ⅰ型與Ⅱ型肌纖維的組成和數(shù)量的比例呈顯著相關(guān)［14］。

為了進(jìn)一步觀察miRNA let-7b不同SNP位點不同基因型對雞生長肉用性狀的影響和調(diào)控作用，本研究以華南農(nóng)業(yè)大學(xué)前期采用廣東省優(yōu)質(zhì)地方肉雞品種杏花雞與快大型肉雞隱性白洛克進(jìn)行雜交所得到的F2代肉雞的生長性狀和肉用性狀資料為研究素材，通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)let-7b前體區(qū)兩個SNP多態(tài)位點（rs712920451和rs71292453）不同基因型對生長肉用性狀存在不同程度的影響。通過統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)SNP多態(tài)位點rs71292045不同基因型與生長肉用性狀中的胸肌率、腿胸比呈顯著相關(guān)，其中胸肌率的優(yōu)勢基因型是GA，腿胸比的優(yōu)勢基因型是AA；SNP多態(tài)位點71292453不同基因型與雞的胸肉重、腿肉重、腿肌率、胸肌率、腿胸比呈顯著相關(guān)，其中胸肉重的優(yōu)勢基因型是TC，腿肉重的優(yōu)勢基因型是CC，腿肌率的優(yōu)勢基因型是CC，胸肌率的優(yōu)勢基因型是TC，腿胸比的優(yōu)勢基因型是TT。

胸肉重、腿肉重是衡量肉雞生產(chǎn)性能的重要經(jīng)濟(jì)性狀，胸肌率、腿肌率、腿胸比等也是評價肉雞經(jīng)濟(jì)性狀的重要指標(biāo)。因此，如何選育胸肉、腿肉重高且胸肌率、腿肌率、腿胸比適宜的肉雞品種是育種研究的重要內(nèi)容。

綜合以上結(jié)果來看，雞的miRNA let-7b前體區(qū)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點對雞的生長肉用性狀具有一定影響，其中對于胸肉重、腿肉重、胸肌率、腿肌率、腿胸比這5個肉用性狀的影響較為突出，通過以上實驗結(jié)果說明，在肉雞選育過程中選擇合適的優(yōu)勢基因型對于肉雞的生長發(fā)育會產(chǎn)生積極的正面影響，對促進(jìn)肉雞的快速生長和肉量的穩(wěn)定提高，改善雞的生產(chǎn)性能和肉用經(jīng)濟(jì)性狀具有重要意義。但從實驗結(jié)果看，miRNA let-7b前體區(qū)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點不同基因型是如何調(diào)控肉用性狀的變化，其作用機(jī)理尚不明確，還需進(jìn)一步的研究與探討。

4 小結(jié)

通過實驗與數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)雞的miRNA let-7b前體區(qū)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點不同基因型與雞的生長肉用性狀（胸肉重、腿肉重、胸肌率、腿肌率、腿胸比）存在顯著的關(guān)聯(lián)，提示rs71292045和rs71292453兩個位點在雞的生長發(fā)育過程中扮演重要角色。本研究結(jié)果可為提高和改善雞的肉用經(jīng)濟(jì)性狀的選育效果提供一定的參考依據(jù)。